规模化培养猪瘟活疫苗生产工艺的试验

郁宏伟, 郑朝朝， 柳 珊， 刘 涛, 刘云涛， 邹立宏

[1.瑞普(保定)生物药业有限公司，河北保定071000； 2.河北省兽医生物技术工程技术研究中心，河北保定071000]

规模化培养猪瘟活疫苗生产工艺的试验

郁宏伟1,2, 郑朝朝1,2， 柳 珊1,2， 刘 涛1,2, 刘云涛1,2， 邹立宏1,2

[1.瑞普(保定)生物药业有限公司，河北保定071000； 2.河北省兽医生物技术工程技术研究中心，河北保定071000]

为建立一种快速、稳定的规模化培养猪瘟活疫苗的生产工艺，本试验将已感染猪瘟病毒的细胞直接接种到生物反应器(工作体积为10 L)，收获病毒液，制备成猪瘟活疫苗。研究结果显示，接种带毒细胞后培养3 d细胞数可增长4～6倍，15 d可收获毒液7次，病毒收获量至少与600个10 L转瓶单次收获量相当，产品各项检测均合格。本试验所建立的生产工艺可大幅度缩短培养时间，提高生产效率，为规模化培养工艺的推广与使用提供了技术参数。

猪瘟 ； 规模化培养 ； 生物反应器

猪瘟是由猪瘟病毒(CSFV)引起的猪的急性、热性、高度接触性传染病，严重危害养猪业[1]。猪瘟被世界动物卫生组织列为必须报告的动物传染病，中国也将其列为一类动物疫病[2]。接种疫苗是预防和控制猪瘟的有效手段。近年来猪瘟常有免疫失败的报道，究其原因疫苗的质量与之有很大的关系[3]。猪瘟疫苗各生产厂家的水平参差不齐，经常出现疫苗效价不稳定，病毒滴度低等问题[4]。因此，本行业亟需提高疫苗产品质量以满足市场需要。应用生物反应器制备疫苗抗原已经成为国内各兽用生物制品生产企业关注和研究的焦点[5]。

1 材料与方法

1.1 细胞、病毒及试验动物 猪睾丸细胞(ST)，购自广东永顺生物制药股份有限公司；猪瘟病毒兔化弱毒株脾毒(CSFV)，由瑞普(保定)生物药业有限公司种毒室提供；安全检验用猪瘟抗体阴性猪，购自河北唐县某猪场；效力检验用家兔，购自河北定州某兔场。

1.2 主要试剂、设备 MEM培养基，购自GIBCO公司；葡萄糖测定试剂盒，购自上海荣盛生物药业有限公司；猪瘟专用新生牛血清，购自武汉三利生物工程有限公司；胰蛋白酶，购自GIBCO公司；AP20C型激流灌注式多功能生物反应系统，购自杭州安普生物工程有限公司(工作容积10 L)。

1.3 带毒细胞制备 以常规方法复苏、传代、增殖ST细胞，至长成良好单层后弃去培养液，接种脾毒，接毒量为3 g/瓶，置于37 ℃温室中继续培养。接毒后第4天进行第一次收获换液，接毒后第8天将已接毒ST消化制备成带毒细胞悬液，备用。

1.4 带毒细胞罐体接种与培养 将带毒细胞悬液接种至生物反应器内。设定设备参数：T1：37 ℃、T2：40 ℃、T3：36 ℃，pH值：7.4，DO值：50%～70%，振荡速度20 r/min，空气流量100 ml/min，启动培养程序，开始病毒培养。当残糖浓度低于1 g/L时，开始补液或者换液，维持残糖浓度，并分析细胞生长情况。

1.5 病毒培养、收获 带毒细胞培养至第3天进行第一次收获，2～7收每48 h进行一次收获，1～6收每次收获完成后向系统内补充9 L细胞维持液，补液后24 h补充200 g/L的葡萄糖，使残糖浓度维持在0.7 g/L。

1.6 半成品检验 无菌检验按现行《中国兽药典》附录进行。半成品病毒含量测定用兔体定型热反应和间接免疫荧光两种方法测定。

1.7 疫苗的制备与检验

1.7.1 疫苗制备 将检验合格的病毒液稀释后混合于同一容器，加入等体积牛乳蔗糖冻干保护剂(5%蔗糖和12%脱脂乳)充分摇匀，定量分装，迅速冷冻真空干燥即得成品。

1.7.2 疫苗安全性检验 按瓶签注明头份，将疫苗用生理盐水稀释为每毫升含6头份，肌肉注射CSFV抗体阴性健康猪5头，每头5 mL，观察21 d。

1.7.3 疫苗效力检验 将疫苗用生理盐水稀释成1/7500头份/mL，耳静脉注射家兔2只，1.0 mL/只，观察96 h。

2 结果

2.1 半成品检验 收获1～7收各收次毒液，检测效价，7个收次的病毒液效力均在5.0×106RID/mL以上(如表1)。

表1 各次收获病毒液的效价 (RID/mL)

7个收次的病毒液按照《中华人民共和国兽药典》(2010年版)附录进行纯净性检验，无细菌、真菌、支原体生长和外源病毒污染；病毒液对猪安全无副作用。

2.2 疫苗成品的安全和效力检验 接种疫苗后观察21日，所有试验猪体温、精神、食欲无明显变化，无异常临床反应，疫苗安全检验合格。

家兔接种疫苗后观察4 d，2只家兔1只为定型热(++)，另1只为轻热(+)，疫苗效力检验合格。

3 讨论

应用生物反应器培养ST细胞生产猪瘟病毒能实现细胞高密度生长，本研究建立了一种规模化培养猪瘟活疫苗生产工艺，通过将已感染猪瘟病毒的细胞直接接种至反应器进行培养，收获病毒液，缩短了生产周期，充分利用了转瓶中可带毒传代的优势，而且自动化水平较高，生产过程稳定可控，降低了产品批间差异，有利于稳定产品质量。

建立的猪瘟病毒生产工艺一个周期病毒收获量至少与600个转瓶的单次收获量相当，该工艺与原有的转瓶生产工艺相比，培养时间缩短一半，大大提高了生产效率，对于稳定产品质量，降低生产成本有明显优势。

采用兔体热反应和间接免疫荧光两种方法对半成品毒液进行了抗原含量检测，根据检测结果可以看出两者之间呈正相关关系，应用间接免疫荧光方法检测抗原含量有很大的可行性。

[1] 张双, 郭慧, 徐浩，等.新型猪瘟疫苗的研究进展[J].中国兽医杂志, 2015, 51(1): 72-74.

[2] 康恺, 林鸷, 高海慧，等, 猪瘟病毒促进细胞自噬并利于病毒增殖[J], 畜牧兽医学报, 2014, 45(9): 1481-1487.

[3] 李安. 猪瘟病毒强毒株与疫苗C株鉴定方法的建立及疫苗病毒定量检测的研究[D], 泰安：山东农业大学, 2010.

[4] 郑朝朝. 脾毒有效期对猪睾丸细胞产猪瘟毒的影响.第四届京津冀一体化畜牧兽医科技创新研讨会论文集[S], 石家庄：2014年6月.

[5] 郑朝朝, 邱贞娜,柳珊.等, 激流灌注式生物反应器培养猪繁殖与呼吸综合征活疫苗(R98株)工艺的研究[J].中国预防兽医学报, 2013.35(2):107-109.

2016-02-24

郁宏伟(1978-)，男，兽医师，博士，主要从事动物用生物制品研究与开发，E-mail: yuhongwei2005@126.com

郑朝朝，E-mail: zhengzhao521@163.com

S852.612

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0529-6005(2017)02-0095-02