MALDI-TOF MS技术在病原菌检测与鉴定中的应用研究

王海花 ， 张晓峰 ， 苗 丽

(1.河南牧业经济学院河南郑州450046 ; 2.河南出入境检验检疫局河南郑州450003)

MALDI-TOF MS技术在病原菌检测与鉴定中的应用研究

王海花1， 张晓峰1， 苗 丽2

(1.河南牧业经济学院河南郑州450046 ; 2.河南出入境检验检疫局河南郑州450003)

病原微生物引起的动物疾病不仅严重影响到动物的经济价值也威胁着人类健康， 随着近年来抗菌药物的滥用导致多种细菌耐药以及部分新型细菌的出现使形势更加严峻。传统的微生物鉴定方法主要有表型的检测，包括革兰染色、微生物分离培养和生化试验等，因时间较长、鉴定范围窄，影响了病原微生物鉴定的速度和准确性，在一定程度上影响了疾病的控制。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(Matrix assisted laser desorption/Ionization time of flight mass spectrometry MALDI-TOF-MS)是近年来发展起来的应用于微生物快速检测的一项技术。基于绘制微生物的蛋白质指纹图谱与已知标准微生物的蛋白指纹图谱数据库进行比较达到鉴定的目的。不同的细菌经MALDI-TOF MS检测可以形成特异性的指纹图谱，建立这些细菌的图谱库，将待测细菌的质谱图与已有质谱图库进行比较，即可确定细菌种属。由于所得到的蛋白质图谱中主要的分子离子峰为菌体内高丰度、表达稳定且进化保守的核糖体蛋白，因此其鉴定结果稳定、可靠。

1 MALDI-TOF-MS技术的原理

将微生物样品和基质溶液以一定比例混合，取数微升上述混合溶液点在靶板上，溶剂挥发后形成样品与基质的共结晶体，利用激光作为能量来源辐射共结晶体，基质从激光中获取能量跃迁成为激发态使样品发生解析离子化，离子在电场作用下加速飞过飞行管道，飞行时间与离子的质荷比(m/z)成正比，分子量较小的分子，飞行的较快，以离子质荷比(m/z)为横坐标，离子峰强度为纵坐标，形成质量图谱，将质量图谱与已知质谱图数据库中的特征性质谱图比对，筛选并确定出特异性图谱，从而实现对目标微生物种或菌株的区分和鉴定。

2 MALDI-TOF-MS在食源性致病菌检测中的应用

根据国家食源性致病菌监测要求,微生物检测项目主要是沙门菌、大肠杆菌O157:H7、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、弯曲菌、副溶血性弧菌、阪崎肠杆菌等。目前对食源性致病菌的病原学检测依赖细菌的生化代谢和血清学反应结果来判定，耗时较长。基于基因型鉴定方法，细菌核糖体基因序列分析、荧光定量PCR检测特定的基因等易出现假阳性结果的想象，而MALDI-TOF-MS方法从首次报道用于微生物的鉴定以来，一直被许多国内外研究学者应用，收到很好的效果。

战晓微等[1]从牛肉骨粉中分离出甲型副伤寒沙门菌的野生分离株，用传统方法与MALDI-TOF-MS方法进行检测比较，MALDI-TOF-MS检测的可信度分值为2.372，检测结果与传统方法一致且准确性较高。Karen L等[2]用MALDI-TOF MS方法对致泻性大肠埃希菌、宋内志贺菌、金黄色葡萄球菌、肠炎耶尔森菌等31株常见食源性致病菌进行成功鉴定，进一步验证了该技术在微生物鉴定方面的可靠性。Barbuddhe S B[3]等应用Maldi-TOF MS方法测试了不同血清型的李斯特菌，不同血清型李斯特菌的特征性峰值不同。该方法与PFGE对不同血清型的李斯特菌比较，表明MALDI-TOF MS可以有效鉴别李斯特菌及其亚型，甚至可以鉴定到种水平。通过对单增李斯特菌标准菌株进行验证，表明鉴定结果的可信度很高。R.Dieckmann等[4]对12个属456致病菌株成功进行了鉴定。资料显示，有很多研究学者采用MALDI-TOF MS方法在宋内志贺菌、克罗诺杆菌、大肠埃希菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、肉毒梭菌、沙门菌等食源性致病菌的快速检测方面进行应用，效果良好。

龚艳清等[5]从冷冻保存的罗非鱼、鳗鱼、大菱鲆、鲤鱼、牛蛙及甲鱼等水生动物中分离的20 株迟缓爱德华菌用MALDI-TOF MS和全自动微生物鉴定仪VITEK方法进行鉴定比较，结果表明，MALDI-TOF-MS方法检测的20株迟缓爱德华菌与数据库中的质谱图匹配比较，分值均在2.35以上，准确性较高。而全自动微生物鉴定仪VITEK检测的迟缓爱德华菌的鉴定值只有85%，说明MALDI-TOF MS方法在重复性、稳定性、准确性等方面总体优于传统生化鉴定方法。战晓微等[6]分别从养殖生猪、动物源性食品以及从食物中毒患者及食品加工人员中分离的47株大肠杆菌分离株，经MALDI-TOF MS方法检测收集菌株的蛋白指纹图谱与数据库中的质谱数据比对分析，结果表明，该47株菌株均为大肠杆菌且可信度分值分布于1.9～2.5之间，与常规方法分离大肠杆菌的鉴定结果一致。可信度分值的差异说明该47株大肠杆菌存在显著差异。

Wang Y等[7]从样品中分离的37株单增李斯特菌，应用MALDI—TOF MS方法采集蛋白质指纹图谱，汇集成单增李斯特菌图谱数据库与标准菌进行验证，并在此基础上对37株单增李斯特菌分离株进行聚类分析，结果表明,MALDI-TOF MS方法将37株单增李斯特菌分离株分成9个型，以此建立了MALDI-TOF MS快速鉴定与分型方法。Bao C M[8]等分别使用直接涂抹法和提取法处理，对200株宋内志贺菌野生株及致泻性大肠埃菌进行鉴定验证，结果表明，宋内志贺菌经涂抹法鉴定准确率为71.5%，而经提取法鉴定准确率为100%，并以此建立了鉴定宋内志贺菌的质谱数据库，通过对比分析宋内志贺菌的离子峰可鉴别到亚种，为鉴定宋内志贺菌提供了一种高效快速的方法。Zheng Q Y等[9]人通过MALDI-TOF MS方法主成分分析及聚类分析，对不同血清型、不同地区来源及不同宿主的74株沙门菌进行溯源分析，结果如表1所示，表明74株沙门菌中宿主及来源地相同或相似的沙门菌蛋白质指纹图谱相似性较好，而宿主及来源不同或较远的沙门氏菌指纹图谱数据差异较大，表明宿主及来源地相似或较远的菌株在菌体蛋白表达上存在差异。

表1 不同菌株来源及数量

Zhao G M[10]等，对32株克罗诺杆菌(28株分离株，4株参考菌株)与相近菌株阴沟肠杆菌、产气肠杆菌应用MALDI-TOF MS与API方法分别进行鉴定，结果显示，MALDI-TOF MS能将32株克罗诺杆菌鉴定到种、属水平的分别为56.2%和37.5%，而API的方法则为75%和21.9%，并且3株菌未获得鉴定结果，其余29株菌的鉴定结果一致。在此试验的基础上利用采集的8种参考菌株的蛋白质图谱数据构建克罗诺杆菌的MALDI-TOF MS数据库，再用相近肠杆菌及该属分离株验证数据库的准确性。结果显示，应用建立的克罗诺杆菌的MALDI-TOF MS数据库对135株克罗诺杆菌分离株进行分析，可信度分值均大于2.0，达到了种水平鉴定要求，通过聚类分析，可进一步分型。这对克罗诺杆菌鉴定与分型提供了一种新的手段。对克罗诺杆菌的快速溯源具有重要参考价值，进一步说明通过自建数据库是提高鉴定结果准确性的方法之一。Zhao H Y[11]等解决了传统方法对克罗诺杆菌的鉴定存在一定的假阳性和假阴性的问题，弥补了现有方法的不足，对克罗诺杆菌(阪崎肠杆菌)的进一步研究提供丰富的科学依据。

3 MALDI-TOF MS在医学微生物检测中的应用

在疾病诊断与研究过程中，质谱技术在病原微生物的鉴定和分型[15],靶蛋白的组织定位[16]等方面取得初步成果。在这些成果中最早报道MALDI-TOF MS方法对病原菌鉴定的研究与应用[17-18]，尤其对于感染性疾病病原临床分离株的鉴定与分型。目前，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)在感染性疾病病原的诊断与应用研究中主要有以下几方面：(1)菌落纯培养的鉴定；(2)样本中无菌部位细菌的直接鉴定；(3)细菌耐药性检测；(4)病毒的检测。

严立等[12]将重庆医科大学附属第一医院送检的临床123株菌株用MALDI-TOF-MS和传统方法进行鉴定比较，123株菌株中大多数是常见的临床相关病原菌(包括葡萄球菌、肠球菌、链球菌、肠杆菌、革兰阳性杆菌等能较全面反映其在临床常规微生物实验室中的表现)。结果表明,MALDI-TOF MS方法可将122株菌株鉴定至种，鉴定可信度为60%～99.9%，尤其对常见菌如金黄色葡萄球菌，表皮葡萄球菌，肠球菌及大多数肠杆菌科细菌，非发酵菌及酵母菌的鉴定能力很好，鉴定准确率可达95%。Wang Y R[13]等利用MALDI-TOF MS方法从门诊腹泻患者粪便分离的88株沙门菌进行分型，88株沙门菌被分为15个型，亲缘关系的差异水平值为100。MALDI-TOF MS方法结合耐药表型分型88株沙门菌分成44个亚型；结合血清学分型88株菌分成46个亚型；结合PFGE分型88株菌分成64个亚型。尽管MALDI-TOF MS方法在血清分型中具有一定的分型能力，然其分型结果与传统结果还存在一定的差异。目前国内外在这方面的研究性文章很少，尚无法断定MALDI-TOF MS在血清分型方面的能力。Sun Z K等[14]用MALDI-TOF MS方法对临床分离的40株葡萄球菌进行耐药性、聚类分析和API Staph系统、Kirby-bauer耐药性鉴定分析对比，40株葡萄球菌的分离株中有34株为金黄色葡萄球菌，6株为其他葡萄球菌，结果与API Staph系统鉴定一致。Kirby-bauer法耐药性检测显示，34株金黄色葡萄球菌其中11株为耐药性金黄色葡萄球菌，23株为敏感性金黄色葡萄球菌，用MALDI-TOF MS方法聚类分析结果与耐药性检测结果一致，试验表明，MALDI-TOF MS方法不仅可区分MRSA(耐药)和MSSA(敏感)，甚至能区分不同类型耐药性，这对快速提供治疗方案和控制感染具有重要的作用。

4 展望

微生物的鉴定分类主要有表型鉴定和基因型鉴定两种方法。表型鉴定属于传统分类鉴定方法，包括分离培养，形态特征，生化反应，血清学，耐药性等分型，鉴定周期较长，一般需要3～5 d。基因型鉴定方法包括(G+C)mol%、DNA杂交、PFGE，16S rDNA序列等，从遗传学及种系角度对病原菌进行鉴定分类。MALDI-TOF MS方法鉴定不是基于微生物的生理生化指标和基因，而是取决于特异性蛋白图谱的比较来进行的，因此MALDI-TOF MS方法是对微生物鉴定分类的一种补充而不是替代。不同的分型方法可以相互借鉴，互相补充。蛋白指纹图谱与基因水平分型结合起来能扩大对亚种水平的分型鉴定能力。

目前MALDI-TOF MS方法具有敏感度高、稳定性好、特异性强、图谱简明，而且操作简单、快捷等特点，越来越多的用于病原性微生物的快速鉴定与分型方面。尽管如此，国内对MALDI-TOF MS方法的研究和应用还处于探索阶段，微生物蛋白指纹图谱数据库中的数据大多数来源于国外资料，虽然我国的研究学者也建立了一些数据库，但一些新型细菌的图谱和罕见菌种尚未被数据库收录，从而导致鉴定困难；而且不同国家和地区的同种菌株也存在一定的地理差异，只有不断的增加不同来源和地区数据库的菌株种类和数量，才能保证鉴定的准确性。另外，MALDI-TOF MS方法对不同菌株的样品处理、质谱图采集和分析、多血清型细菌的分型鉴别准确性等方面还有许多问题需要研究改进和完善。

随着MALDI-TOF MS技术的不断完善和提高，尽管该技术在微生物分类研究、食源性致病菌，感染性疾病病原的鉴定与分类方面取得一定的成果，但在畜牧兽医行业的检测方面仍然是一个空白，随着蛋白质谱技术的提高，相信一定能填补这方面的空白。

[1] 战晓微，傅俊范，郑秋月,等.沙门氏菌MALDI-TOF-MS检测方法的建立[J].现代食品科技,2011,27(5): 595-597.

[2] Karen L，Wahl，Sharon C，etal．Residual agar determination in spores by electrospray ionization mass spectrometry[J].Analytic Chemistry,2008,74(24)：7767-7778．

[3] Barbuddhe S B,Maiert,Schwarzg,etal．Rapid identification and typing ofListeriaspeciesby matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry[J]．Aplied and Environmental Microbiology，2008，74(11)：5402-5407．

[4] Dieckman R，Helmuth R，Eehard M，etal.Rapid classification and identification of Salmonellae at the species andsubspecies levels by whole—cell mamx-assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry[J]．Aplied andEnvironmental Microbiology，2010，82(4)：1200-1206．

[5] 龚艳清，郭书林，陈信忠,等.MALDI-TOF-MS 在爱德华氏菌检测中的应用[J].中国动物检疫，2014,31(6):89-93.

[6] 战晓微,杜影,王宏伟,等.MALDI-TOF MS 方法快速鉴定大肠杆菌及ESBLs 菌株检测探索研究[J]. 食品安全质量检测学报,2015,6(1):99-105.

[7] Wang Y，Cao J J，Zhao X，etal．Identification and subtyping ofL/ster/a monocytogenes by matrix assisted laser desorption/ionization.time of flight mass spectrometry[J]．Food Science，2012，33(3)：194-198．

[8] Bao C M，Song X A，Cui E B，etal．Clinical application of marx-assisted laser desorption ionization.time of flightmass spectrometry for the identification of Shigella sonnei[J]．Infectious Disease Information，2014，27(3)：152-155．

[9] Zheng Q Y，Zhan X W，Xu Y，etal．Traceability analysis of foodborne pathogen Salmonella by matrix assisted laser desorption ionization.time offlight mass spectrometry[J]．Food Science and Technology，2013，38(12)：315-320．

[10] Zhao G M，Yang H R，Zhao Y S，etal．Comparison of MALDI-TOF MS biotyper with the phenotyping methods APl20E for identification ofcronobactespp[J].Chinese Journal of Health Laboratory Technology，2010，20(3)：464-466.

[11] Zhao H Y，Lv J，Lu Y，etal．Identification ofEnterobactersakazakiiby matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry[J]．Chinese Journal of Microecology，2013，25(5)：541-547．

[12] 严立，徐绣宇，张莉萍,等.基质辅助激光解析电离飞行时间质谱对临床常见细菌和酵母菌的鉴定能力评价[J].生物医学工程与临床，2015,19(2):105-108.

[13] Wang Y R，Cui S H，Li F Q．Study on detection and identification of salmonella species by matrix assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry[J]．Journal of Hygiene Research，2008，37(6)：685-689．

[14] Sun Z K,Zhang W,Chen X P.Rapid method study of methicinin resistant Staphylococcus aureus identified by matrix-assisted laser desorptionio/nization-time off light mass spectrometry[J]．Journal of Hygiene Research，2004，33(5)：552-554．

[15] Gekenidis M T, Studer P, Wuthrich S,etal,Bebyond the matrix-assisted Laser desorption ionization biotyping workflow: in search of microorganism specific tryptic peptides enabling discrimination of subspecies[J].Appl Environ microbiol, 2014,80(14):4234-4241.

[16] Fujimura Y, Miura D.MALDI mass spectrometry imaging for visualizing in situ metabolism of endogenous metabolites and dietary phytochemicals endogenous metabolites and dietary phytochemicals[J].Metabolites,2014,4(2):319-346.

[17] Anhalt J P, Fenselau C.Identification of bacteria using mass spectrometry[J]. Anal Chem,1975,47(2):219-225.

[18] Keys C J,Dare D J,Sutton H,etal. Compliation of a MALDI-TOF MS database for the rapid screening and characterization of bacteria implicated in human infections diseases[J].infect Genet Evol,2004,4(3):221-242.

2016-08-10

国家质量监督检验检疫总局科技项目(2015IK113)

王海花(1977- )女，讲师，硕士，主要从事兽医微生物学教学研究工作，E-mail:whh9023@sina.com

苗丽，E-mail:ml5628@163.com

R446.8

A

0529-6005(2017)02-0062-03