培元解郁方对慢性应激BALB/c小鼠的抗抑郁作用及TRY-KYN代谢途径的调节

李海娜 张 静 李丽娜 范盎然 于 雪 王萍萍 刘保秀 畅洪昇

(1 北京中医药大学中药学院，北京，100102； 2 北京中医药大学基础医学院，北京，100029)

培元解郁方对慢性应激BALB/c小鼠的抗抑郁作用及TRY-KYN代谢途径的调节

李海娜1张 静1李丽娜2范盎然2于 雪2王萍萍1刘保秀1畅洪昇1

(1 北京中医药大学中药学院，北京，100102； 2 北京中医药大学基础医学院，北京，100029)

目的：研究四逆散、天丝饮、培元解郁方的抗抑郁作用及其对血清皮质酮含量和色氨酸(TRP)-犬尿氨酸(KYN)途径关键代谢酶色氨酸2,3-双加氧酶(TDO)的影响。方法：使用束缚加噪声造成小鼠抑郁模型，采用Noldus EthoVision XT9系统采集分析小鼠强迫游泳不动时间，采用HPLC-MS/MS技术检测血清色氨酸(TRP)、犬尿氨酸(KYN)、犬尿烯酸(KA)、喹啉酸(Q)、皮质酮(C)含量，实时荧光定量PCR检测肝组织中TDO的mRNA表达水平。结果：束缚加噪声应激5 d后可以引起模型组小鼠强迫游泳不动时间延长，血清皮质酮含量增高，KYN/TRP、KYN/KA比值升高，KYN/Q比值降低。四逆散、天丝饮、培元解郁方能缩短小鼠不动时间(P<0.01)，降低血清皮质酮含量(P<0.05)，提高KYN/TRP、KYN/Q比值(P<0.05)，降低KYN/KA比值。结论：四逆散、天丝饮、培元解郁方具有抗抑郁药物样作用，这一作用与对抗应激引发的血清皮质酮升高，抑制色氨酸-犬尿氨酸代谢途径中的神经毒性代谢产物产生并提高神经保护作用有关。

四逆散；天丝饮；培元解郁方；抗抑郁；色氨酸-犬尿氨酸

本实验将四逆散、天丝饮进行合方，组成培元解郁方，采用慢性应激BALB/C小鼠抑郁模型，对3个处方的抗抑郁作用进行了观察，并就其对色氨酸(Tryptophan，TRY)-犬尿氨酸(Kynurenine，KYN)代谢途径及其关键酶TDO含量的影响进行了研究，以明确三者的抗抑郁效应和机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物 雄性BALB/C小鼠，体重(22±3)g，60只，购自北京金牧阳实验动物养殖有限责任公司。许可证号：SCXK(京)2011-0004。

1.2 药品和试剂 培元解郁配方颗粒由制巴戟天(批号：15001781)、北柴胡(批号：13002303)、盐菟丝子(批号：15004252)、白芍(批号：13002773)、炙甘草(批号：13002752)、麸炒枳实(批号：120601)组成。天丝饮配方颗粒由制巴戟天、盐菟丝子组成。四逆散配方颗粒由北柴胡、白芍、炙甘草、枳实组成。上述药材饮片颗粒均由北京康仁堂药业有限公司提供。盐酸丙咪嗪片(批号：20140302A)，上海信谊九福药业有限公司生产。

皮质酮(Corticosterone，货号C0388，TCI)，DL-犬尿氨酸(货号61250，Sigma)，犬尿喹啉酸(货号K3375，Sigma)，喹啉酸(货号A11414，Alfa Aesar)，色氨酸(货号T103480，Aladdin)，5HT(货号111656-200401，中检所)，甲醇、已腈等均购自Fisher公司。Trizol(货号：15596026，Invitrogen)，HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒(货号CW0744)，UItraSYBR Mixture(货号CW0957)，均购自Cwbio公司。氯仿、异丙醇、乙醇均为分析纯。

1.3 实验仪器 HPLC-MS/MS(美国戴安Ultimate3000-ABI公司3200 Q TRAP)，Noldus EthoVision XT9(荷兰Noldus公司)，荧光定量PCR仪(美国CFX96)。

1.4 分组和给药 将BALB/C小鼠随机分为空白组、模型组、阳性药组、四逆散组、天丝饮组、培元解郁方组，每组10只。除空白组外，其余小鼠每天上午8点至10点、下午16点至18点进行束缚加噪声刺激(25Hz)。连续应激5 d，应激同时灌胃给药。小鼠给药剂量按临床等效剂量换算，丙咪嗪给药剂量为50 mg/kg，天丝饮配方颗粒给药剂量为1.5 g/kg，四逆散配方颗粒给药剂量为0.8 g/kg，培元解郁配方颗粒给药剂量为4.6 g/kg。各组小鼠分别于末次应激后进行行为学检测，行为检测结束之后取材，并对所取样品进行相关指标测定。

1.5 强迫游泳实验 将小鼠置于水深10 cm的玻璃缸中，玻璃缸高25 cm，直径10 cm，水温保持在25 ℃，观察6 min内小鼠的游泳情况，并记录后4 min的累计不动时间，数据由Noldus EthoVision XT9采集分析。

1.6 血清色氨酸(TRP)、犬尿氨酸(KYN)、犬尿烯酸(KA)、喹啉酸(Q)、皮质酮(C)含量测定 行为学测试结束后取材。小鼠摘眼球取血，血液于4 ℃冰箱静置，凝血后离心，转速2 500 r/min、温度4 ℃，时间15 min，离心后吸取上清并置-20 ℃冷冻保存。待血清样本融化后(和稀释好的标准品)蜗旋1 min后取200 μL，高速13 200 r/min，冷冻离心5 min，取上清液用HPLC-MS/MS检测犬尿氨酸(KYN)、色氨酸(TRP)、犬尿烯酸(KA)、喹啉酸(Q)、皮质酮(C)含量，以犬尿氨酸/色氨酸比值表示TDO活性，犬尿氨酸/犬尿烯酸反映神经保护作用，犬尿氨酸/喹啉酸比值反映神经毒性作用。

1.7 液相条件 色谱柱SLab HP-C18(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温30 ℃，流速0.8 mL/min，流动相A为水，流动相B为乙腈，进样量为20 μL。梯度洗脱：0～1 min，流动相B体积分数为95%；1～8 min，流动相B体积分数为95%～40%；8～8.1 min，流动相B体积分数为40%～0%；8.1～10 min，流动相B体积分数为0%；10～10.1 min，流动相B体积分数为0%～95%；10.1～15 min，流动相B体积分数为95%。

1.8 质谱条件 离子源为+ESI电喷雾离子源，正离子方式；扫描方式采用MRM多反应监测；气帘气：20psi；碰撞气：Medium；喷雾电压：+5 500 V；雾化温度：500 ℃；雾化气：55 psi；辅助气：60 psi；射入电压：10；碰撞室射出电压：2.0。

1.9 肝TDO含量检测 将肝脏置于液氮内速冻，采用一步法抽提肝脏总RNA，吸取1 μL肝脏总RNA溶液，用0.8%的琼脂糖凝胶进行电泳，用HiFi-MMLV cDNA第一链合成试剂盒进行反转录，用UItraSYBR Mixture进行扩增，采用荧光定量PCR方法检测含量，具体实验操作参考产品说明书。用2-△△ct法对数据进行相对定量分析。目的基因引物：TDO F序列为AAGGATTCAGGCTAAAACCGACT，TDO R序列为TGCACGGTATGACAGTCGTC，扩增产物大小为146bp。

表1 对小鼠强迫游泳行为的影响

注：与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。

2 结果

2.1 强迫游泳 慢性束缚加噪声刺激能够延长模型组小鼠的强迫游泳不动时间。而与模型组相比较，盐酸丙咪嗪、四逆散、天丝饮、培元解郁方组小鼠游泳不动时间显著缩短，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 血清TRY-KYN代谢产物及皮质酮含量 与模型组相比，丙咪嗪、四逆散、天丝饮、培元解郁方组血清皮质酮含量降低。空白组、丙咪嗪、四逆散、天丝饮、培元解郁方组KYN/TRP比值增大，差异有统计学意义(P<0.01)，四逆散、天丝饮、培元解郁方组KYN/Q比值增大，差异有统计学意义(P<0.01)，培元解郁方组KYN/KA比值降低，差异有统计学意义(P<0.01)。见表2、表3。

表2 对血清皮质酮含量的影响

注：与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。

表3 对慢性应激BALB/C小鼠TRY-KYN代谢途径的影响

注：与模型组相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3 肝脏TDOmRNA表达的影响 与空白组比较，慢性应激组TDO mRNA表达有所提高，但差异不明显；与慢性应激组比较四逆散、天丝饮、培元解郁方组TDO mRNA也有所提高，但差异无统计学意义。见表4。

表4 对TDOmRNA表达的影响

3 讨论

本实验所研究的3个中药复方分别是四逆散、天丝饮和培元解郁方，其中培元解郁方来自于四逆散和天丝饮的合方。四逆散出自《伤寒论》，是经典的疏肝解郁的祖方[1]。近年来研究表明：四逆散在多种动物抑郁模型中起到抗抑郁作用，其抗抑郁机制与影响5-HT能神经元，促进海马神经元发生和神经营养[2]，保护额叶和海马神经元线粒体的损伤[3]，缓解应激后高度活跃的下丘脑-皮质-肾上腺轴等有关[4]。天丝饮出自《辨证录》，具有补肾元、定神志的功效，是治疗健忘、惊悸、恐惧等情志病的基本方。天丝饮由菟丝子和巴戟天组成，研究表明，巴戟天中的巴戟天寡糖和菟丝子中的金丝桃苷均具有较好的抗抑郁作用。中医对抑郁症有虚郁相关的发病和治疗思想，并由此形成了培元解郁的治法[5]，本实验以这一理论为基础来研究四逆散与天丝饮合方抗抑郁作用及其对TRY-KYN代谢途径的影响。

实验动物采用BALB/c小鼠。BALB/c小鼠是一个常用的近交系小鼠品系，具有较低的社会性，利用BALB/c小鼠能较好的复制人类的一些心身疾病模型[6-7]。本实验用BALB/c小鼠成功的复制了抑郁症模型，模型组动物强迫游泳不动时间延长，表现出“行为绝望”的抑郁状态。

应激指当机体受到各种有害刺激，如缺氧、创伤、手术、饥饿、疼痛、寒冷等时做出相应的应答状态，包括神经、免疫和内分泌等多方面的综合反应，研究表明应激状态下，机体HPA轴兴奋性提高，血中ACTH浓度立即增加，糖皮质类固醇(GC)分泌也相应增加，从而动员储能，使血糖升高，心血管张力提高，而与此同时免疫功能被抑制。目前常用的应激抑郁模型有慢性不可预见性温和应激、慢性束缚应激、行为绝望、获得性无助、糖皮质激素等。其中慢性束缚应激指长时间剥夺身体的自由活动，束缚制动刺激作为应激源的应激动物模型，是一种慢性的非耗竭性应激[8]。研究表明慢性束缚应激可引起动物“行为绝望状态”，即强迫游泳实验或悬尾实验不动时间延长，如采用慢性束缚应激诱导BALB/c小鼠抑郁模型，行为学测试显示模型小鼠悬尾不动时间明显延长(P<0.01)[9]。本实验在慢性束缚的基础上又增加了噪声刺激来诱导抑郁模型，以加强诱导抑郁模型的效果，缩短造模时间。强迫游泳实验结果显示慢性应激可以引起模型组小鼠强迫游泳不动时间延长，而四逆散、天丝饮、培元解郁方三个中药复方均能缩短小鼠游泳不动时间，作用效果与丙咪嗪相似，抗抑郁作用较强。

抑郁症的发病涉及到神经-内分泌-免疫多种系统的失衡[10]，目前存在多种假说，其中较为公认的有细胞因子假说，下丘脑-垂体-肾上腺皮质(HPA)轴假说，单胺能假说，神经可塑性假说等。近年来，色氨酸—犬尿氨酸(TRY-KYN)代谢异常逐渐受到重视。色氨酸是神经递质5-HT的合成原料，能够在色氨酸羟化酶作用下合成5-HT，而在IDO或TDO的作用下，则发生TRY-KYN代谢形成犬尿氨酸等活性产物。当TRP-KYN代谢发生异常，5-HT的合成原料色氨酸耗竭，造成5-HT合成降低进而引发5-HT能神经元功能障碍；而与此同时TRP-KYN代谢产生的犬尿氨酸进一步生成神经元活性代谢产物喹啉酸，喹啉酸的增加使NMDA过度激活和自由基的产生，进而引发中枢特定部位神经元变性[11-12]。TDO主要存在于肝脏内，是肝脏内色氨酸的主要降解酶。TDO活性的增强，可促进TRP-KYN代谢，而研究表明应激状态下的HPA轴兴奋性提高，肾上腺分泌应激激素糖皮质类固醇(GC)升高，而持续高水平的糖皮质激素不仅能导致海马损伤而引起抑郁症；还能增加色氨酸-犬尿氨酸通路的降解酶TDO的表达和活性[13]，进而促进TRP-KYN代谢，导致色氨酸耗竭，造成5-HT合成降低，研究表明5-HT不足可使杏仁核抑制作用减弱，继而皮质醇产生增多，大脑皮质兴奋，出现情绪不稳或烦躁失眠等抑郁症状[14]。另外犬尿氨酸神经元活性代谢产物的增加，是TRP-KYN代谢异常引发抑郁症的又一原因，犬尿氨酸有2种代谢途径，一是在犬尿氨酸羟化酶的作用下生成3-羟基犬尿氨酸继而在多种酶的催化下生成喹啉酸(Q)。另外一条通路是在犬尿氨酸氨基转移酶的作用下生成犬尿烯酸(KA)。喹啉酸是NMDA受体的内源性激动剂，具有很强的神经毒性，其水平升高可能导致轴突的神经退行性疾病[15]，3-羟基犬尿氨酸则引起神经元的凋亡。而犬尿烯酸是NMDA受体的内源性拮抗剂，能够对抗喹啉酸产生的神经毒性作用，具有神经保护作用[16-17]。有研究表明通过脑室外注射犬尿烯酸可缓解促肾上腺皮质激素释放激素诱发的隔离应激雏鸡的异常行为(如觉醒时间延长和鸣叫次数增多)[18]。

在本实验中，应激组血清皮质酮含量与对照组相比升高，而丙咪嗪、四逆散、天丝饮、培元解郁方组血清皮质酮含量显著降低，表明四逆散、天丝饮、培元解郁方组能够对抗皮质酮，从而减轻其对海马组织的损伤而发挥抗抑郁作用。但是，丙咪嗪、四逆散、天丝饮、培元解郁方并不能通过降低血清皮质酮含量引起TDO活性及表达的降低，相反，本研究中，TDO活性反而明显增强。其原因可能是，TDO活性还受胰高血糖素、高浓度辅酶(如NADPH)、甲基吡啶羧酸羧化酶(PAC)、3-羟-2-氨基苯甲酸加氧酶(3-HAAO)、活性雌激素、血红蛋白等含量的影响。在本实验的研究中，上述因素可能通过调节TDO的活性而参与到TRP-KYN的代谢中来，其机制有待进一步研究。另一方面，四逆散、天丝饮、培元解郁方可以升高KYN/Q比值，其中培元解郁方尚可以降低KYN/KA比值，表明3组方均可以使色氨酸-犬尿氨酸通路具有神经毒性的代谢产物喹啉酸减少，而培元解郁方同时能增加具有神经保护作用的代谢产物犬尿烯酸。提示3组方可以促进犬尿氨酸向有利机体的方向代谢，间接的调节NMDA受体活性，进而抑制神经毒性，提高神经保护作用。

综上，四逆散、天丝饮、培元解郁方3组方具有一定的抗抑郁作用，该作用与对抗皮质酮，同时促进TRP-KYN以有利于机体的方式代谢，间接的调节NMDA受体活性，抑制TRP-KYN通路神经毒性代谢产物产生，提高神经保护作用等有关。其中，四逆散、天丝饮合方组成的培元解郁方在抗抑郁作用及调节TRP-KYN代谢产物方面有更好的效应。

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(2016-02-22收稿 责任编辑：张文婷)

Antidepressant Effects of Peiyuan Jieyu Decoction on Chronic Stress BALB/C Miceand Its Regulatory Mechanism on TRY-KYN Metabolism

Li Haina1, Zhang Jing1, Li Lina2, Fan Angran2, Yu Xue2, Wang Pingping1, Liu Baoxiu1, Chang Hongsheng1

(1SchoolofChinesePharmacy,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100102,China; 2SchoolofPreclinicalMedicine,BeijingUniversityofChineseMedicine,Beijing100029,China)

Objective:To study the influence of antidepressant effects of Sini Powder, Tiansi Liquid, and Peiyuan Jieyu Decoction on corticosrone and tryptophan 2, 3-double enzyme (TDO) and key metabolism enzyme of the tryptophan-kynurenine (TRP-KYN) pathway. Methods:The mice model was established by chronic stress. The immobility time in forced swimming test was acquired and analysed by Noldus EthoVision XT9 system. Tryptophane, kynurenine, kynurenic acid, quinaldinic acid and corticosrone in serum were detected by HPLC-MS/MS technique. The mRNA expression level of TDO in liver was detected by real-time PCR. Results:After five days chronic stress, the immobility time of model group mice was prolonged. The serum corticosterone levels, KYN/TRP and KYN/KA specific value increased and KYN/Q specific value decreased. Tiansi Liquid, Sini Powder and Peiyuan Jieyu Decoction could shorten the immobility time of mice (P<0.1). It could also cut the corticosterone levels (P<0.05); increased KYN/TRP and KYN/Q specific value (P<0.05) and reduced the KYN/KA specific value. Conclusion:Sini Powder, Tiansi Liquid and Peiyuan Jieyu Decoction have antidepressant effect. The mechanism may be related to the increase of serum corticosterone induced by stress reaction and the reduce of neurotoxicity during the TRY-KYN metabolim and improvement of nerve protection.

Sini Powder; Tiansi Liquid; Peiyuan Jieyu Decoction; Anti-depression; TRY-KYN

国家自然科学基金项目(编号:81373584)

畅洪昇(1971.10—)，男，博士，副教授，硕士研究生导师，研究方向：主要从事中药药效及作用机制方面的研究，E-mail：chs1971@sina.com

R285.5

A

10.3969/j.issn.1673-7202.2017.01.037