大气CO2浓度升高对转基因玉米Bt毒素表达量的影响

刘凯强, 解海翠, 张天涛, 白树雄, 王振营, 何康来*

(1.中国农业科学院植物保护研究所, 北京 100193; 2. 河北科技师范学院生命科技学院, 秦皇岛 066000)

大气CO2浓度升高对转基因玉米Bt毒素表达量的影响

刘凯强1, 解海翠2, 张天涛1, 白树雄1, 王振营1, 何康来1*

(1.中国农业科学院植物保护研究所, 北京 100193; 2. 河北科技师范学院生命科技学院, 秦皇岛 066000)

大气CO2浓度升高不仅影响植物营养化学成分的变化, 还能够引起植物次生抗虫物质表达量的改变, 进而影响作物-害虫的互作关系。本试验利用开顶式气室(OTC)和室内动态气室模拟当前和未来大气CO2浓度(约390、550、750 μL/L)环境, 测定了不同大气CO2浓度下普通玉米‘郑58’和转cry1Ac-m基因玉米的营养物质成分、转cry1Ac-m基因玉米Cry1Ac杀虫蛋白的含量, 以及取食不同大气CO2浓度环境下生长的‘郑58’或转cry1Ac-m基因玉米叶片的亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)初孵幼虫死亡率。结果表明, 与对照相比, 高大气CO2浓度(750 μL/L)环境下生长的转基因和对照玉米叶片中淀粉、可溶性糖、非结构性碳(TNC)含量及TNC∶N都明显增加, 而N含量差异不显著。对照玉米叶片的N含量显著高于转基因玉米, 其他营养成分没有显著变化。随着大气CO2浓度的升高, 转基因玉米的Cry1Ac蛋白表达量有下降的趋势, 但各处理间差异不显著。亚洲玉米螟取食生长在不同大气CO2浓度环境下的‘郑58’或转cry1Ac-m基因玉米叶片48 h后,死亡率没有显著差异;转cry1Ac-m基因玉米具有显著的杀虫效果。

大气CO2; 转基因玉米; 亚洲玉米螟; Bt毒素

大气CO2浓度上升可提高植物的光合能力和生产力, 影响植物组织内化学物质累积。一方面, 大气CO2浓度升高影响植物营养化学物成分的变化,多数研究报道认为大气CO2浓度升高使植物组织内C/N增加, 即组织内碳水化合物含量提高, 含N化合物含量降低[1-5];另一方面, 大气CO2浓度升高也会引起植物次生抗虫物质的表达发生变化, 如大气CO2浓度升高会促进针叶林总酚和单萜的积累[6]。紫苜蓿Medicagosativa(L.)组织中皂苷含量随着大气CO2浓度升高而显著提高, 但组织中黄酮类化合物含量变化不大[7]。大气CO2浓度升高环境下生长的转基因棉花棉铃内Bt蛋白表达量显著降低[8]。

玉米是重要的粮食、饲料及工业原料, 亚洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)是严重为害玉米的重要害虫。转基因抗虫玉米的出现, 为防治玉米害虫提供了新的途径, Bt蛋白作为转基因玉米表达的最重要的外源性抗虫物质, 在大气CO2浓度升高情况下的表达量变化是一个值得研究的问题。目前, 关于大气CO2浓度升高下, 转基因玉米Bt蛋白表达量变化的研究尚未见报道。

本试验测定了不同大气CO2浓度下普通玉米‘郑58’和转cry1Ac-m基因玉米的营养物质含量、转cry1Ac-m基因玉米Cry1Ac杀虫蛋白表达量, 并测定了取食两种玉米离体组织的亚洲玉米螟初孵幼虫的死亡率, 为未来气候变化情境下转基因玉米抗虫性的变化趋势与利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 不同大气CO2环境

试验于2015年在15个正八边形开顶式气室(open-top chamber, OTC)内进行(直径4.2 m, 高3.8 m), 气室位于吉林省公主岭市中国农业科学院植物保护研究所野外科学观测试验站。试验设置3个大气CO2浓度处理, 即约390 μL/L(当前大气CO2浓度)、 550 μL/L和750 μL/L(通过预测得到的未来大气CO2浓度)[9-10]。OTC由气室、控制室及控制系统组成, 具体结构和调控方式详见文献[11]。OTC内试验设计采用裂区设计, 大气CO2浓度为主区, 玉米品种为裂区, 即先按照大气CO2浓度设置3个处理的小区(主处理);然后在主处理的小区内引进玉米品种的2个处理(副处理),共有6个处理, 重复5次。

1.2 供试玉米

试验所用玉米品种包括转cry1Ac-m基因玉米(启动子:花椰菜花叶病毒启动子CaMV35S,终止子:胭脂碱合成酶基因(nos)终止子), 对照‘郑58’(转基因玉米受体), 均由中国农业大学玉米中心提供。于5月10日播种, 行距50 cm, 株距30 cm, 每气室中间以60目纱网分开, 左右两侧分别种植30株转基因玉米和对照玉米。

1.3 供试亚洲玉米螟

亚洲玉米螟O.furnacalis来自吉林省公主岭市田间自然发生种群, 在室内用人工饲料[12]饲养数代后备用。

1.4 玉米组织内化学物质含量测定

玉米播种45 d后, 每小区随机取5株玉米, 取其叶片剪碎混匀后测定碳水化合物和Cry1Ac蛋白等化学物质含量。非结构性碳(淀粉和糖类)采用Tissue和Wright[13]的方法测定。用凯氏定氮法(Model KDY-9830 凯氏定氮仪,北京)测定氮含量。采用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)测定Cry1Ac蛋白含量, 试剂盒为Agdia公司生产(试剂盒货号:PSP06200,检测灵敏度:0.01 ppb)。

1.5 玉米叶片室内生测

分别采集3个大气CO2浓度OTC中的玉米叶片, 放在直径9 cm的塑料培养皿中(皿盖上有直径3.5 cm圆孔, 覆以100目尼龙纱网, 保证培养皿内的CO2浓度), 接入亚洲玉米螟初孵幼虫50头。每处理分两组, 分别放在CO2浓度与叶片生长环境相同的人工气候箱(CDCC-1型, 宁波赛福PRX-450D-CO2)和当前大气CO2浓度人工气候箱(CDCC-1型, 宁波赛福PRX-450D)内饲养。人工气候培养箱内温度为白天(28±1)℃, 夜间(27±1)℃;相对湿度75%～85%;光周期L∥D=16 h∥8 h。

1.6 数据统计分析

对玉米品质的影响和对玉米螟死亡率的影响采用裂区设计的方差分析, 对Bt毒素表达量采用单因素方差分析, 平均数比较采用LSD检验,P<0.05。统计分析计算用SAS软件实现。

2 结果与分析

2.1 玉米叶片化学成分含量

不同大气CO2浓度环境下生长的玉米, 其叶片的可溶性糖和淀粉含量差异显著, 而N含量差异不显著(表1), 因而非结构性碳比氮(TNC∶N)差异显著。与当前大气CO2浓度相比, 在750 μL/L CO2浓度环境下生长的玉米叶片可溶性糖、淀粉、TNC含量和TNC∶N分别增加了15.9%、10.3%、12.0%和17.3%, N含量没有显著差异;而在550 μL/L CO2浓度环境下生长的玉米叶片除TNC∶N显著升高了7.0%外, 其余参数无显著差异(图1)。与550 μL/L CO2浓度相比, 750 μL/L CO2浓度下生长的玉米叶片可溶性糖含量、TNC含量和TNC∶N显著升高了16.4%、9.0%、9.5%, 淀粉含量没有显著差异。

‘郑58’玉米叶片的N含量极显著地高于转基因玉米, 对照玉米和转基因玉米的可溶性糖、淀粉、TNC含量和TNC∶N没有显著差异(表1, 图1)。品种和CO2的交互作用对玉米叶片的可溶性糖、淀粉、TNC、氮含量、TNC∶N都没有显著影响(表1)。

图1 不同CO2浓度下玉米叶片中几种化学物质含量及不同玉米品种叶片的氮含量Fig.1 Contents of several compounds in the leaves of maize under different CO2 levels and N content in the leaves of different varieties of maize

化合物Compound二氧化碳CO2品种Variety二氧化碳×品种CO2×Variety可溶性糖SolublesugarF5.254.521.83df2,271,282,24P0.0350.0550.202淀粉StarchF5.660.730.64df2,271,282,24P0.0290.4100.542非结构性碳TNCF8.874.192.32df2,271,282,24P0.0090.0630.141氮NF3.1526.920.86df2,271,282,24P0.098<0.0010.448非结构性碳∶氮TNC∶NF19.350.341.62df2,271,282,24P<0.0010.5730.239

2.2 Cry1Ac蛋白表达量

由表2可知,随着大气CO2浓度的升高,转基因玉米组织中Cry1Ac蛋白表达量有下降的趋势, 但不同浓度间没有显著差异。

表2 不同CO2浓度下生长的转cry1Ac-m基因玉米叶片的Cry1Ac蛋白表达量

Table 2 Cry1Ac protein contents in the leaves of GM maize under different CO2levels

CO2浓度/μL·L-1CO2levelCry1Ac蛋白表达量/mg·g-1QuantityofCry1AcproteinMean±SEFdfP约3901.91±0.090.362,120.70625501.88±0.067501.82±0.08

2.3 不同处理下亚洲玉米螟48 h的死亡率

组织离体生测结果显示, 不同玉米品种的杀虫效果差异显著(表3)。与‘郑58’玉米相比, 转cry1Ac-m基因玉米有显著的杀虫效果, 亚洲玉米螟初孵幼虫取食48 h后, 死亡率都达到了95.8%以上, 而取食‘郑58’玉米的死亡率小于7.4%(表4)。不同大气CO2浓度处理的亚洲玉米螟幼虫存活率间差异不显著, 且大气CO2浓度与品种间交互作用不显著(表3)。

表3 不同处理间差异显著性方差分析统计参数

Table 3 Statistic parameters of analysis of variance among the treatments

变异来源Sourceofvariance统计参数StatisticparameterdfFP玉米品种Cornvariety982343.16<0.0001大气CO2浓度AtmosphericCO2971.010.4172玉米品种×大气CO2浓度Cornvariety×atmosphericCO2950.320.8629

表4 不同处理间亚洲玉米螟48 h的死亡率

Table 4 Mortality ofOstriniafurnacaliswithin 48 h among different treatments

玉米品种Cornvariety生长环境大气CO2浓度/μL·L-1AtmosphericCO2levelofambientenvironment生测环境大气CO2浓度/μL·L-1AtmosphericCO2levelofbioassayenvironment死亡率/%Mortalityrate郑58 Zheng58约390约3905.4±1.49郑58 Zheng58550约3907.4±2.11郑58 Zheng58750约3905.6±2.17郑58 Zheng585505505.6±1.71郑58 Zheng587507505.0±2.20转cry1Ac-m基因玉米Transgeniccornexpressingcry1Ac-mgene约390约39095.8±1.41转cry1Ac-m基因玉米Transgeniccornexpressingcry1Ac-mgene550约39099.4±0.31转cry1Ac-m基因玉米Transgeniccornexpressingcry1Ac-mgene750约39097.2±0.80转cry1Ac-m基因玉米Transgeniccornexpressingcry1Ac-mgene55055097.4±0.67转cry1Ac-m基因玉米Transgeniccornexpressingcry1Ac-mgene75075096.8±1.04

3 讨论

大气CO2浓度升高,使植物光合作用底物浓度增加,光合作用效率增加,提高植物生产力,相当于“施肥效应”[14-15],同时引起植物组织内不同化合物成分与含量发生变化[16-18]。然而,不同作物对“施肥效应”的反应水平或效果差异较大。关于大气CO2浓度升高对植物营养成分含量影响的研究很多,但大多数集中在对C3植物的研究上,对C4植物的研究相对较少。本试验研究显示,大气CO2浓度升高,玉米叶片中淀粉和可溶性糖含量、TNC∶N都明显增加,这与前人的研究结果相同[5,8,19]。一般来讲,大多数植物(尤其是C3植物)的光合作用速率和生长会随着CO2浓度的升高而提高[20-21],进而会提高叶片对C/N和水利用效率,叶片N含量降低[22-23]。另一些研究则认为,大气CO2浓度升高对不同作物的影响不同。如生长在高CO2浓度环境下的红车轴草Trifoliumpratense(L.)和草木樨Melilotusalba(Desr.)(C3植物,豆科)的C、N含量以及C/N没有差异[24]。即使是同一作物,不同研究者所用品种与栽培方式不同、测定的组织不同,其结果也存在差异。如,大气高CO2浓度环境下,盆栽的‘Kedan 8’玉米籽粒中蛋白、TNC/蛋白显著增加,但TNC的含量差异不显著[25],而在直播的‘XY335’玉米叶和茎中TNC含量比对照均显著增加[11]。土壤的施N量也会影响植物组织的C/N[26-27]。在本试验中,不同大气CO2环境下生长的玉米叶片的N含量差异不显著。这可能与品种有关,本研究所用玉米品种为自交系‘郑58’及其转cry1Ac-m基因品系。但本研究中TNC/N 的结果与已报道的玉米相关研究结果一致。

与对照玉米相比,转基因玉米叶片N含量显著降低,其他营养成分差异不显著,这可能与外源基因的插入有关。Chen等[8]的研究也发现生长在CO2浓度为750 μL/L的开顶式气室环境中的转基因棉花的N含量显著低于非转基因棉花。

Bt蛋白属于转基因玉米植株内的氮源抗虫物质,转cry1Ac-m基因玉米叶片中Cry1Ac杀虫蛋白表达量没有随着大气CO2浓度的升高而改变,这与本试验中玉米叶片N元素含量没有显著变化保持一致。有报道表明,转Bt基因抗虫棉棉铃内Bt杀虫蛋白表达量受大气CO2浓度升高影响而显著降低,降低幅度与棉花中N含量有关[8,25,28],而Coviella等[29]报道,大气CO2浓度升高的情况下,改变土壤施N量,叶片的含N量和Bt蛋白的表达量变化是一致的,即随着施N量的增加,使得叶片N含量和Bt蛋白表达量下降的趋势变得不显著。白树雄[30]研究认为外源基因的导入并没有对转基因玉米抗虫次生物质产生影响,这与本试验结果一致。外源基因的导入是否会引起转基因作物体内次生代谢物质表达量的变化是有争议的，如有研究表明转基因棉植株体内的单宁酸、棉酚表达量与对照亲本表达量不同[31]。因此,转Bt基因抗虫作物外源杀虫Bt蛋白的表达量是否受大气CO2浓度升高的影响因作物品种、土壤中氮肥含量、外源基因导入方式等而异。

对玉米组织的离体生测结果显示,转cry1Ac-m基因玉米品种相比‘郑58’的杀虫效果显著,这与试验中大气CO2浓度升高对转基因抗虫玉米Bt蛋白表达量没有显著影响一致。本试验只进行了离体玉米组织的抗虫性研究,而在大气CO2浓度升高情况下,田间不同品种玉米的抗虫性鉴定需要进一步的研究。

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(责任编辑：田 喆)

Effects of elevated atmospheric CO2concentration on the expression of Bt toxin in transgenic maize

Liu Kaiqiang1, Xie Haicui2, Zhang Tiantao1, Bai Shuxiong1, Wang Zhenying1, He Kanglai1

(1.InstituteofPlantProtection,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China; 2.CollegeofLifeScienceandTechnology,HebeiNormalUniversityofScienceandTechnology,Qinhuangdao066000,China)

Elevated CO2(eCO2) will generally lead to the change of chemical composition of plants. On the other hand,eCO2may also mediate the changes in plant secondary metabolism, which will affect the plant-herbivore interaction. This research simulated the growth and development of the corn line ‘Zheng 58’ and a line expressing Bt Cry1Ac toxin (GM-line),Ostriniafurnacalisand their interactions under ambient environment with twoeCO2(about 390 μL/L, 550 μL/L, 750 μL/L) with open top chambers (OTCs) and closed dynamic chambers (CDC). Corn plant chemistry, especially the C and/or N contents as well as Cry1Ac toxin were assessed. The results showed that the starch and soluble sugar content, TNC and TNC∶N were significantly increased in the plant tissues undereCO2(750 μL/L) OTC, but the N contents in leaves were not significantly different among CO2concentrations. However, the N content in leaves of ‘Zheng 58’ was significantly higher than that in GM-line. Although the amount of Cry1Ac toxin expressed in GM-line leaves declined along with the increase in atmospheric CO2level, there was no significant difference among atmospheric CO2treatments.eCO2did not significantly affect the mortality ofO.furnacalisin 48 h. The survival rate was significantly lower in GM-line.

atmospheric carbon dioxide; transgenic maize;Ostriniafurnacalis; Bt toxin

2016-05-03

2016-07-10

公益性行业(农业)科研专项(201303026)

S 435.132

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.02.010

* 通信作者 E-mail: klhe@ippcaas.cn