一株纤维素高产菌株的选育及其鉴定

葛含静

(陕西学前师范学院生命科学与食品工程学院， 陕西西安 710100)

■自然科学研究

一株纤维素高产菌株的选育及其鉴定

葛含静

(陕西学前师范学院生命科学与食品工程学院， 陕西西安 710100)

细菌纤维素具有高结晶度、生物可降解性和合成可调控性等优良特性，被公认是一种性能最好的纤维素，广泛应用于食品、医学、造纸、声学等领域。实验室自制荞麦醋自然放置一段时间，液面上长出厚厚的凝胶状膜，经成分分析，确定其为纤维素，结晶度为78%，Iα型纤维素含量为60%。取该荞麦醋的醪液，经富集、分离、初筛和复筛等，最终从108个单菌落中筛选出1株性能稳定的纤维素高产菌株J2，纤维素产量可达87.62 g/L(湿重)。通过形态学与基于16S rRNA序列的分子生物学鉴定，确定菌株J2为汉森氏葡糖醋杆菌(Gluconacetobacter hansenii，GenBank登录号为GU213109)。

细菌纤维素；菌株；鉴定

细菌纤维素是某些海洋生物(如被囊纲动物)和细菌(醋酸杆菌、假单孢杆菌、 土壤杆菌、无色杆菌、八叠球菌等菌属的细菌)代谢产物，由β-1,4-D-吡喃葡萄糖聚合而成，不掺杂任何其他形式的多糖，纯度极高[1]。与普通植物纤维相比，BC机械强度高、吸水保水率高、生物适应性良好，被认为是性能最好的纤维素，广泛应用于食品、医药、造纸、石油开采等领域[2]。

目前，学术界对BC的合成研究主要是围绕培养基及培养条件的优化、菌株的代谢工程改造、高产菌株的自然选育及诱变选育等方面展开。陈军等[3]利用糖厂副产物——酸化糖蜜生产BC，发现产量显著提高，且用红茶菌的复合菌种能更高效地利用碳源。夏露等[4]利用甲醇废水发酵生产BC，以木醋杆菌静态发酵，BC产量较低。杨雪霞等[5]研究发现剪切力会影响纤维素产生菌的形态和生物量，不利于BC 合成。翁媛媛等[6]以惰性吸附载体固态发酵生产BC，避免剪切力的同时使固液界面的表面积增加了，BC产量为液态静置发酵产量的 3 倍，但后处理难度增加了很多。Carolina等[7]对Ga.hanseniiATCC23769纤维素合成酶操纵子中部分基因进行克隆，采用过表达这些基因以期提高BC产量。周胜虎等[8]从腐烂的水果中自然分离得到BC产生菌JX303335。余晓斌等[9]和杜双奎等[10]分别通过紫外诱变和高静水压诱变方法实现了BC高产突变株的成功选育。尽管BC生物合成的研究在各个方面都取得了长足进展，但从源头上自然筛选出性能稳定的BC高产菌株，优化其发酵条件，表征所产BC性能指标，仍具有重要的研究意义。

本研究成功筛选出了1株BC产量高且传代稳定的菌株J2，并对其进行鉴定，同时，对菌株J2所产BC的超微结构和超分子结构也做了鉴定，为后续通过诱变或基因工程方法选育优良的BC产生菌株奠定了基础。

1 材料

1.1 实验材料

实验室自制荞麦醋。

1.2 实验试剂

细菌基因组提取试剂盒、2000 bp DNA marker和Ex Taq酶，均购自日本TakaRa公司。DNA胶纯化及回收试剂盒，购自美国Amersham Biosciences公司。细菌16S rRNA通用扩增引物F9/R1510及测序引物F9，R1510和F520，上海生工合成。其它试剂均为分析级或生物级。

1.3 培养基

富集培养基：葡萄糖20 g/L，酵母膏5 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 10 g/L，无水乙醇体积分数为2%，制霉素0.05 g/L，pH值自然。

基础种子培养基：葡萄糖20 g/L，酵母膏5 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 15g/L，无水乙醇体积分数为2%，pH值自然。分离培养基和斜面保藏培养基同基础种子培养基，加琼脂 1.7%。

基础发酵培养基：葡萄糖20 g/L，酵母膏5 g/L，K2HPO41 g/L，MgSO4·7H2O 10 g/L，无水乙醇体积分数为2%，pH值自然。

所有培养基均在121 ℃ 高压灭菌15 min后备用。

2 方法

2.1 菌种筛选

按照微生物自然筛选的方法，进行富集、分离、初筛和复筛，筛选出纤维素产量最高且稳定的菌株[11]。

BC产量的测定：将活化的种子液按10%接种量(体积分数)接入1 L发酵培养基，8层灭菌纱布封口，30 ℃静置培养5 d，测定处理后的BC产量。BC处理方法：用蒸馏水过夜冲洗BC膜，然后浸泡于0.5 M NaOH溶液中煮至乳白色半透明状[12]。处理后的BC膜在滤纸上沥干，称重(即BC湿重)；将沥干的BC膜在烘箱中于105 ℃烘至恒重，称重(即BC干重)。纤维素产量用g纤维素/L培养液表示。

2.2 凝胶状膜成分分析[11]

定性分析：在培养皿中放入一张新的载玻片，倒入蒸馏水，能覆盖载玻片即可。挑取培养2 d的凝胶状膜，自然平展于载玻片上，取出载玻片并晾干，向膜上滴66.5%的硫酸，然后用碘液染色，在显微镜下观察显色情况。

酶解试验：取凝胶状膜，于105 ℃烘干至恒重，准确称取0.5000 g，剪碎，加入纤维素酶溶液中，55 ℃长时间保温，若溶液变清亮且烘干后膜的重量减轻90%以上，则可确定凝胶状膜主要成分为纤维素。

2.3 BC结构鉴定

超微结构表征：用扫描电子显微镜(Scanning electronic microscope，SEM)观察。BC干膜用双胶碳导电带安装在一截铜段上，用铂涂层设备为BC膜涂铂，室温进行扫描电镜拍照。

超分子结构表征：用固态13C-核磁共振光谱(Nuclear magnetic resonance，NMR)测定过夜水洗并烘干的纤维素的结晶度和晶体类型。测试频率75.46 MHz，脉冲宽度38 KHz，接触时间1 ms，转子转速5～6 KHz，转角54.7°，循环时间3 s。每个光谱2400次扫描。

2.4 菌种鉴定

形态学鉴定：取对数期菌体，结晶紫染色后用光学显微镜观察菌体形态；同时，取对数期菌体划线接种于种子培养基平板，30 ℃培养3～5 d，观察菌落形态。

分子生物学鉴定：用细菌基因组提取试剂盒提取BC产生菌株基因组DNA。以基因组为模板，F9/R1510为引物扩增16S rRNA序列。产物以2%琼脂糖凝胶电泳检测，由上海生工测序。序列在国际核酸数据库( NCBI) 中进行Blast同源性比对，用MEGA4绘制系统发育树，结合表型特征确定其生物学地位。

3 结果与讨论

3.1 BC产生菌株筛选

涂布分离得到108个单菌落(依次编号J1，J2，…，J108)。初筛发现，有9株菌能产凝胶状膜，3株所产凝胶状膜松软、有空洞。对能产膜的9株菌连续5代传代培养，发现编号J2的菌株的每一代培养物性状稳定、凝胶状膜产量最高(平均87.62 g/L)，且膜外观结实、平滑、有弹性。

3.2 凝胶状膜成分分析

被染色为深蓝色的物质在显微镜下呈无规则层状分布，包裹着未染色的杆状菌体细胞。初步判断，凝胶状膜主要成分为纤维素。酶解50 h后溶液变清亮，酶解前膜重0.5002 g，酶解后重0.0236 g，因此，纤维素含量为(0.5002-0.0236)/0.5002=95.28%。可以确定，凝胶状膜的主要成分为纤维素。

3.3 BC结构鉴定

超微结构：如图1，碱煮处理的BC中菌体残留更少；水洗与碱煮后BC超微结构没有变化，说明纯化方法对纤维素的微观结构没有影响，这与Brigid等[13]的研究结果一致。此外，BC的微纤维直径不足0.1 μm，呈密集网状，很多根微纤维组成纤维丝带，进而形成不计其数的不规则、相互叠加的孔穴，即三维网状结构。这种结构持水保水性能良好，也有利于吸附有机试剂，故BC可用作吸水材料和吸附材料，用于食品加工及药物缓释体系中[14]。

1.水洗处理BC；2.NaOH处理的BC图1 菌株J2所产BC的SEM图

超分子结构：对比天然纤维素的NMR图谱(图2)，图3中信号均为纤维素信号，说明菌株J2所产BC纯度高；结晶度达78%，Iα型纤维含量达60%。生物材料的结晶度与其拉伸性能、尺寸稳定性及密度呈正相关[15]，故菌株J2所产BC拉伸性能及尺寸稳定性良好、密度高。Iα型是纤维素的亚稳态结构，在一定条件下可转化为稳定的Iβ晶型，BC具有很强的生物适应性且在环境中易于分解，很可能是由于其中Iα型纤维含量高[16]。因此，与高等植物相比(Iα型纤维含量为30%[17])，菌株J2所产BC生物适应性良好。

图2 天然纤维素的13C-NMR图谱[18]

图3 菌株J2所产BC的13C-NMR图谱

3.4 菌种鉴定

3.4.1 形态学鉴定

J2菌体细胞呈杆状，单个或成对，大小为(2.12～4.18)μm×(0.81～0.92)μm；菌落呈圆形，表面光滑，凸起，不透明，乳白色，大小为0.9～1.4 mm，见图4，可初步判断菌株J2为醋酸杆菌属。

图4 菌株J2菌体细胞形态(×1000)和菌落形态

3.4.2 分子生物学鉴定

对菌株J2进行16S rRNA序列扩增及系统发育分析，如图5和图6，菌株J2与菌株Ga.hanseniiNBRC14817、Ga.hanseniiNBRC14816和Ga.hanseniiNBRC14820同枝，相似度达100%。

M，DNA Marker DL2000图5 菌株J2的16S rRNA基因

图6 基于16S rRNA基因序列构建的菌株J2的系统发育树

微生物的分类鉴定从来没有一个黄金指标。表型特征虽可进行表型分群，但分类学结果不够精准，故而只能用于描述微生物的表型性状特征。遗传学分类法，即根据核酸分析得到的遗传相关性所做的分类，以决定生物表型特征的遗传特征DNA和RNA作为比较的准绳，是一种更客观和高度可信的分类方法。因此，表型鉴定与遗传学分类法结合，可以更为准确地对未知微生物进行分类鉴定。故结合形态学鉴定与基于16S rRNA序列扩增的分子生物学鉴定，即可确定，菌株J2是汉森氏葡糖醋杆菌(Ga.hansenii)。

4 结论

本研究从实验室自制荞麦醋中自然分离出一株性能良好的BC高产菌株J2，其BC结晶度为78%，Iα型纤维含量为60%，表明BC密度高，拉伸性、尺寸稳定性和生物适应性均良好。通过形态学鉴定与基于16S rRNA序列的分子生物学鉴定，确定菌株J2为汉森氏葡糖醋杆菌(Ga.hansenii)。

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[学术编辑 赵大洲]

[责任编辑 朱毅然]

Study on Inscreening and Identification of a High-yield Bacterial Cellulose-producing Strain

GEHan-jing

(CollegeofLifeScienceandFoodEngineering，ShaanxiXueqianNormalUniversity，Xi’an710100，China)

It was universally accepted that bacterial cellulose(BC) was the best cellulose of high crystallinity，well biodegradability，synthesis of controlled，etc. So it was widely used in the areas of food，medicine，paper making and acoustics etc. There was thick gelatinous membrane on the surface of the lab homemade buckwheat vinegar after natural placement for a period of time. The analysis results showed that the membrane was BC. And the crystallinity index was 78%，and the cellulose Iα contents was 60%. A high-yield BC-producing strain with about 87.62 g/L wet weight and stable characteristics named J2 was isolated from 108 strains screened in the vinegar by enrichment cultivation，separation，initial screening and re-screening. At last，strain J2 was identified asGluconacetobacterhansenii(GenBank accession GU213109)by morphological identification and molecular identification based on 16S rRNA sequence.

bacterial cellulose;strain;identification

2016-11-06;

2016-11-26

陕西省科技厅自然科学基础研究计划项目(2016JQ3036)；陕西学前师范学院校级科研项目(2015YBKJ027)

葛含静，女，陕西咸阳人，陕西学前师范学院生命科学与食品工程学院讲师，工学博士，主要研究方向：粮食工程与发酵技术创新、营养学。

Q19

A

2095-770X(2017)03-0144-05

http://sxxqsfxy.ijournal.cn/ch/index.aspx

10.11995/j.issn.2095-770X.2017.03.032