柠檬烯抗菌性研究进展

郝静梅，盛冉，孙志高*，黄巧娟，于奉生，方明

1(西南大学 柑桔研究所，重庆，400712) 2(广东省食品药品职业技术学校，广东 广州，510663)

柠檬烯抗菌性研究进展

郝静梅1，盛冉1，孙志高1*，黄巧娟2，于奉生1，方明1

1(西南大学 柑桔研究所，重庆，400712) 2(广东省食品药品职业技术学校，广东 广州，510663)

柠檬烯(limonene)是广泛存在于植物中的一种天然单萜烯，是自然界除蒎烯外分布最广的萜烯，具有抗菌、消炎和抗肿瘤等多种生物功能。当前食品卫生和医药安全等问题越来越引起公众的重视，研究天然的抗菌保鲜剂已成为研究的热点。此文综述了近年来柠檬烯对微生物的抑制作用、作用机理、应用及发展趋势，以期为安全、高效的天然食品防腐保鲜剂的开发及应用提供参考。

柠檬烯；抗菌；作用机制；应用

柠檬烯又称苧烯，学名1-甲基-4-(1-甲基乙烯基)环己烯，是一种重要的单环单萜烯，广泛存在于柑橘、蔬菜等植物中，尤其在柑橘类水果的精油中含量较多，如在甜橙果皮精油中其含量高达90%～95%[1-3]。天然柠檬烯以3种异构体的形式存在于植物精油中，即D-柠檬烯、L-柠檬烯和DL-柠檬烯，其中D-柠檬烯最为常见。由于柠檬烯具有抗菌、抗氧化、抗癌、止咳平喘和抗炎等生理功能，已被广泛应用于食品、香料、医药和化工等领域[4]。

随着人们安全意识的日益增加，食品安全问题是食品行业最关心的问题，研究证实真菌和细菌是引起食品腐败变质的重要因素[5]。化学类食品防腐剂如山梨酸、苯甲酸、丙酸及其盐类等因抑菌性强、使用成本低等特点，在食品行业应用广泛，但由于这些防腐剂溶解性低、安全性差及致癌性等问题，也越来越显示出局限性[6]。近年的相关研究表明，植物类的天然抗菌性成分可替代化学防腐剂来防止食品的腐败变质，如中国国家标准(GB2760—2011 食品添加剂使用标准)规定D-柠檬烯即为允许使用的香料[7]，同时柠檬烯也因来源广泛、安全性好和抗菌性强等优点，成为当下研究热点。

1 柠檬烯的抗菌特性

柠檬烯具有广谱抗菌性，可显著抑制革兰氏阳性细菌、革兰氏阴性细菌及真菌的活性[8]。柠檬烯的抗菌强度与柠檬烯的浓度、菌株种类、作用形式、pH值、温度、作用时间和试验方法等多因素有关，同时柠檬烯的易挥发性、疏水性及是否添加表面活性剂等均会导致抑菌结果的差异性[8]。

1.1 柠檬烯抑制细菌

食品在加工及贮藏过程中容易受到金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、假单胞菌和枯草芽孢杆菌等细菌的污染，近年来通过国内外学者对柠檬烯的抗菌性研究证实，柠檬烯对这些细菌均有较好的抑制作用，详见表1。

1970年，DABBAH等[9]研究了橙、柠檬及葡萄柚的除萜精油、D-柠檬烯、香叶醇等在体外对山夫登堡沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和假单胞菌属的抑制作用，结果表明D-柠檬烯对这4种菌的抑制率为86%～100%，同时发现已放置4年的D-柠檬烯比新产柠檬烯对山夫登堡沙门氏菌的抑制性更强，抑制率高达100%，这是因为柠檬烯氧化生成了柠檬烯氧化物，它对山夫登堡沙门氏菌具有更强抑制作用。2008年，O′Bryan CA[12]等研究证实D-柠檬烯对试验用11种沙门氏菌均有抑制作用，其最小抑菌体积分数为1%。LIS-BALCHIN等[15]研究了柠檬烯的2种对映体在体外对20种单细胞增生李斯特菌的抗菌性，结果表明(+)-柠檬烯具有更强的抑菌活性，这两种柠檬烯对映体的抗菌性强弱差异是因所作用的菌种不同所致。

表1 柠檬烯对细菌的抑制作用

1.2 柠檬烯抑制真菌

近年来研究表明柠檬烯和含有柠檬烯的精油均具有抗菌性，且能抑制多种真菌(如表2所示)，但研究表明D-柠檬烯对真菌的抑制作用比精油更强。2011年，MAHDAVI等[11]采用琼脂扩散法和纸片扩散法研究了柠檬烯和果皮提取物对黑曲霉菌、黄曲霉菌及青霉菌等的抑制作用，结果表明左旋柠檬烯比右旋柠檬烯的抑菌性强，柠檬烯对受试菌均有显著的抑制作用，尤其对黑曲霉菌的抑制作用更为明显，而柑橘香精油对受试菌没有表现出明显的抑菌性。2012年李巧巧等[12]研究了D-柠檬烯及柑橘精油对酵母、毛霉和青霉等的抑菌性，将浸透精油或柠檬烯的滤纸片放置于已干燥的培养基表面，在合适的条件下培养，结果表明抑菌由强到弱依次为D-柠檬烯、柠檬油、柚油、橙油；将浸透精油或柠檬烯的滤纸片放在培养皿的皿盖中心，并倒置培养后发现，只有D-柠檬烯能对酵母、青霉形成抑菌圈。SINGH等[16]研究了柑橘香精油及其主要成分柠檬烯的抗菌活性，发现柠檬烯对黄曲霉的抑制性比香精油更强，即使在很低浓度下仍然具有很好的抑制效果，详见表2所示。

表2 柠檬烯及含柠檬烯的香精油对真菌的抑制作用

2 柠檬烯抗菌机理

近年来，大量文献证实柠檬烯具有广谱的抗菌性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、黄曲霉等细菌和真菌均具有抑制作用[1-26]。然而到目前为止柠檬烯的抗菌机理尚未获得明确结论，但研究者普遍认可，通过破坏菌体细胞膜的完整性，从而抑制微生物生长是柠檬烯的主要抗菌机制。综合文献报道柠檬烯的抗菌机理主要为以下几方面。

2.1 破坏微生物的生物膜

柠檬烯作用于菌体的细胞壁或生物膜系统，进而破坏其完整性，改变细胞膜的渗透性，使内容物外泄，降低其生物活性，从而导致细胞不能正常生长繁殖，甚至死亡。

1989年KNOBLOCH等研究证实精油中的生物活性成分可渗透细胞的细胞壁，溶解细胞膜磷脂的双分子层发挥其抗菌性[26]。2006年 ROSANGELA等[27-28]研究了柠檬烯、肉桂醛、丁香酚和香芹酚等物质在亚致死浓度条件下对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肠道沙门氏菌、荧光假单胞菌和嗜热甲烷八联球菌细胞膜的影响，经过扫描电镜观察到，柠檬烯等物质作用于受试菌后，能引起细胞膜结构的明显变化；通过气相色谱分析发现，受试菌的细胞膜中其不饱和脂肪酸的含量明显减少，其中C18∶2反式脂肪酸和C18∶3的顺式脂肪酸大幅度减少，也直接导致细胞膜总脂肪酸含量的减少，进而发挥出柠檬烯的抗菌作用。2014年TAO等研究了柠檬烯、柠檬醛等单萜类化合物对青霉和绿霉的抑制作用，通过电镜扫描发现，处理组的霉菌形状发生了明显的扭曲和体积变小，且细胞外电导率和pH值也发生了变化，这表明柠檬烯破坏了霉菌的细胞膜，导致细胞内容物泄漏，降低了其生物活性、进而阻碍了霉菌细胞的生长[29]。胡菲菲[30]通过对酿酒酵母耐受D-柠檬烯胁迫的蛋白组分的分析，认为D-柠檬烯破坏了酿酒酵母的细胞膜结构，导致细胞膜脂筏受损，直接破坏了酿酒细胞膜的信号传递和物质转运功能。ESPINA等[31-35]研究了D-柠檬烯对大肠杆菌、单细胞增生李斯特菌等的抑菌作用与机制，发现在pH值为4.0时D-柠檬烯可破坏微生物的细胞膜，暴露出细胞质及细胞质膜增加了细胞膜通透性，导致因内容物泄漏而破坏细胞正常的生理功能，从而现实抑菌。

2.2 影响微生物的能量代谢

生命活动都是耗能反应，能量代谢是维持细胞正常生命活动的基础，能量代谢异常或中断可引起生命活动的停止。柠檬烯可通过干扰菌体内正常的酶促反应和能量代谢，从而打破微生物的代谢平衡。KNOBLOCH等[26]研究了萜类物质对微生物的初生能量代谢、NADH活性以及呼吸过程中电子传递过程等作用，结果表明柠檬烯浓度在5×10-3mol/L时就可起到抑制作用，干扰细胞内能量代谢的酶促反应，并通过溶解油脂影响生物膜的催化反应，如呼吸代谢途径等。胡菲菲[30]在研究酿酒酵母耐受D-柠檬烯胁迫的蛋白组学分析时发现，在D-柠檬烯的胁迫下酿酒酵母对能量的需求增加，出现葡萄糖饥渴的假象。

2.3 破坏微生物DNA的结构或改变其功能

DNA作为生物遗传信息的载体，在细胞物质合成和遗传代谢过程中起到十分重要的作用。DNA的微小损伤都会影响微生物的正常代谢和繁殖。柠檬烯能破坏DNA结构、抑制基因的正常表达，进而影响微生物正常的生长代谢。胡菲菲[30]研究发现，D-柠檬烯能胁迫下调酿酒酵母细胞中具有DNA修复功能的Rp4p和调控细胞增殖分裂功能的Cprlp，从而抑制细胞增殖。

2.4 抑制微生物体内的酶或功能蛋白

MAREI等[36]研究了包括柠檬烯在内的12种物质抗真菌活性，以及柠檬烯对受试菌的果胶甲酯酶、纤维素酶和多酚氧化酶的抑制作用。其结果表明，柠檬烯对果胶甲酯酶和纤维素酶有强烈的抑制作用，而对多酚氧化酶没有抑制作用，认为柠檬烯等单萜类物质抑制了纤维素酶和果胶甲酯酶的活性，延缓或终止了微生物的化学反应，进而产生抗菌作用。

3 柠檬烯抗菌性的应用

柠檬烯具有资源丰富、来源广泛、天然安全等优势，已在食品、果蔬的防腐保鲜等领域得到了很好应用。李巧巧等[12]对D-柠檬烯的抗菌性在面包上的应用进行了初步研究，结果证实D-柠檬烯在气体状态下能有效抑制那些能导致面包腐败的酵母和青霉菌，能对面包起到较好的防腐保鲜作用。高红亮等[37]研究了柠檬烯乳化及其在橙汁中的保鲜效果，发现浓度不低于0.5 g/L的柠檬烯乳化液就能对橙汁起到显著的保鲜效果，其细菌总数、pH值变化及感官品质等指标均明显优于对照组。

4 结论与展望

综上所述，从柑橘皮渣中提取的柠檬烯具有广谱的抑菌性，能有效抑制微生物的生长及预防食品腐败变质，可部分替代化学抗菌剂。但柠檬烯作为新型抑菌剂还有待进一步研究。一方面，关于柠檬烯的抑菌性研究大多数都集中在离体试验，而活体试验很少，研究结果的科学性、广谱性等也受此局限，不利于柠檬烯的进一步广泛应用；另一方面，目前柠檬烯的抑菌性研究还处于初步阶段，对柠檬烯的抑菌机理研究尚不十分准确。此外，柠檬烯的应用技术研究及相关产品的开发也很少。因此，作者认为，今后应系统、深入研究柠檬烯在活体中的抑菌效果、进一步明确柠檬烯的抑菌机理，同时加大开发适应市场发展方向和需求的柠檬烯相关新产品。

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Research progress in antimicrobial activity of limonene

HAO Jing-mei1, SHENG Ran1, SUN Zhi-gao1*, HUANG Qiao-juan2,YU Feng-sheng1, FANG Ming1

1(Southwest University,Citrus Research Institute, Chongqing 400712,China)2(Guangdong Food and Drug Vocational-technical School,Guangzhou 510663,China)

Limonene is one of the most widely distributed terpenes in nature except pinene, and it has many bioactivities such as antibacterial activity, anti-inflammatory activity, and anti-tumor activity. Currently,food hygiene and medical safety have attracted more and more public attention. Studies on natural biopreservatives have become the focus of multidisciplinary research. The antifungal activity of limonene, its action mechanism, its application and development trend were reviewed in this paper to provide a theoretical reference for the development and application of natural food preservatives.

limonene; antibacterial; mechanism of action; application

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201702046

硕士研究生(孙志高副研究员为通讯作者，E-mail: cpro@cric.cn)。

四川省科技支撑计划项目(项目编号：2014NZ0062)

2016-08-18，改回日期：2016-10-31