中药复方制剂治疗桃源鸡大肠杆菌病的试验

张保平+李娜

摘 要：為比较5组中药复方制剂在体外抑菌作用的效果，筛选对常德地区桃源鸡大肠杆菌抑菌作用较好的组方，按中医药配伍原则，选用15种单味中药配伍出5组复方制剂。采用常规水煎煮法制备水提物，分别用平板打孔法、试管二倍梯度稀释法及平板接种法对临床分离的鸡大肠杆菌进行药物敏感性和最小抑菌浓度测定。以对临床分离的大肠杆菌株敏感性较高的头孢曲松作对照，采用自拟中药复方制剂对人工感染的桃源鸡大肠杆菌病进行治疗试验和预防保护性试验，并对其疗效进行评价。结果表明，中药复方制剂II（紫地榆、石榴皮、黄连）和复方制剂IV（五倍子、乌梅、黄芩）水提液对大肠杆菌体外抑菌作用较好，其最小抑菌浓度分别是0.016，0.008 mg·mL-1 ；中药复方制剂III（黄柏、白芍、诃子）和复方制剂V（白头翁、马齿苋、茯苓）水提液抑菌作用次之，最小抑菌浓度均是0.063 mg·mL-1；复方制剂I（唐菖、大黄、金银花）抑菌作用最小，其抑菌浓度为0.500 mg·mL-1，其菌落数随药物浓度升高呈降低趋势。中药复方制剂II和头孢曲松都可以有效控制人工感染大肠杆菌后桃源鸡的临床症状，明显降低鸡只死亡率，中药复方制剂II和头孢曲松对大肠杆菌病治疗率分别是80.0%和86.6%，都高于感染组；中药复方制剂II预防大肠杆菌病的保护率是83.3%，与头孢曲松一致。

关键词：中药复方制剂；桃源鸡；大肠杆菌病；疗效

中图分类号：S858.31 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2017.03.004

Experiment on Treating Tao-Yuan Chicken Colibacillosis by Compound Chinese Herbal Medicine

ZHANG Baoping1， LI Na2

（1. Department of Agriculture and Forestry Engineering， Changde Vocational Technical College， Changde， Hunan 415000， China； 2.Zoology Key Laboratory of Hunan Higher Education， Hunan University of Arts and Science， Changde， Hunan 415000， China）

Abstract： The fifteen Chinese herbal medicines were Gladiolus gandavensis， Radixet rhizome， Rhei palmati， Lonicera japonica， Geranium strictipes， Pericarpium punicae Granati， Rhizoma coptidis， Phellodendron amurense Rupr.， Paeonia sterniana Fletcher in Journ.， Fructus chebulae， Galla chinensis， Fructus mume， Radix scutellariae Baicalensis， Radix pulsatillae， Herba portulacae Oleraceae， Glabrous greenbrier Rhizome. The bacteriostatic activities of 5 groups compound chinese herbal medicine prescriptions against enterotoxigenic Escherichia coli were observed by Plate punching method and serial dilution test. Compound chinese herbal medicine prescription was selfmade according to Chinese veterinary theory. With ceftriaxone highly sensitive to the isolated strain of Escherichia colias control， the cure and preventing protective test were made on colibacillosis in chicken infected artificially to evaluate its curative effect on Tao-Yuan chicken Colibacillosis. Escherichia coli was highly sensitive to the compound chinese herbal medicine prescriptions II and IV， The minimal inhibitory concentration （MIC） were 0.016， 0.008 mg·mL-1. Moderately sensitive to the medicine prescriptions III and V， both MIC were 0.063 mg·mL-1. But prescriptions I was lowly sensitive effect， MIC was 0.500 mg·mL-1. The Chinese herbal medicine and its medicinal formula had better treatment effect， low residue and low drug resistance. Both Chinese herbal compound prescription and ceftriaxone could control the clinical symptoms of chicken infected artificially by Escherichia coli effectively and decrease the death rate significantly. The cure protective rate of Chinese herbal compound prescription and ceftriaxone to Escherichia coli were 80.0 % and 86.6 %， respectively， greatly higher than that in infection control group. Chinese herbal compound prescription had better protective effect on preventing colibacillosis in chicken with the protective rate of 83.3 %， which was the same with that of ceftriaxone.

Key words： Chinese herbal medicine； Tao-Yuan chicken； colibacillosis； curative effect

大肠杆菌病是严重威胁养鸡业发展的常见病，目前尚无有效疫苗可以预防，临床治疗多用抗生素，而抗生素的不合理使用，造成大肠杆菌的耐药性不断提高[1]。中药以其资源丰富、低毒高效、成本低廉等优点，在治疗疾病和动物保健等方面都有一定优势[2-6]。近年来，用中药防治畜禽疾病已成为健康养殖业的发展趋势[7]。

本试验选用15 种单味中药，按中医药配伍原则组出5组复方制剂，按常规方法制备中药水提物，对分离的致病大肠杆菌进行体外抑菌试验，测定最小抑菌浓度（MIC），比较中药复方制剂的抑菌作用以及比较中药复方制剂对人工感染的鸡大肠杆菌病治疗效果，旨在为中药复方制剂的临床应用提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料与试剂

供试细菌是2006—2012 年实验室自行分离、鉴定并保存的[8]；常规试剂均购自杭州微生物试剂有限公司。白芍、唐菖蒲、大黄、紫地榆、石榴皮、黄柏、诃子、乌梅、黄芩、白头翁、五倍子、马齿苋、黄连、土茯苓、金银花15种中药均购于常德市某中药店。

1.2 仪器设备

麦氏比浊管（北京中西远大科技有限公司）；电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）；水浴锅（永兴昌医疗器械厂）；烘箱（上海科学仪器有限公司）；电炉（北京科伟永兴仪器有限公司）；生化培养箱、高压蒸汽灭菌锅（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）；超净台（上海浦东物理光学仪器厂）；粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；冰箱（青岛海尔股份有限公司）。

1.3 方 法

1.3.1 药液制备 将15 种单味中药按比例混合配制成5 组复方制剂。复方制剂I：唐菖蒲、大黄、金银花；复方制剂II：紫地榆、石榴皮、黄连；复方制剂III：黄柏、诃子、白芍；复方制剂IV：五倍子、乌梅、黄芩；复方制剂V：白头翁、土茯苓、马齿苋。水提物按常规水煎煮法制成。4 ℃保存备用。

1.3.2 大肠杆菌活化及浓度测定 将分离的大肠杆菌先接种于琼脂斜面活化，再接种于2 mL营养肉汤中，37 ℃培养24 h，取100 μL菌液加于2 mL营养肉汤中扩增培养，37 ℃培养18 h后进行比浊和活菌计数。最后配制成浓度1×109 cfu·mL-1菌液，保存备用。

1.3.3 体外抑菌试验 参照CLSI（临床和实验室标准化研究所）抗菌药物敏感性试验标准，采用平板打孔法[9]进行药物体外抑菌试验。抑菌作用判定按《中药药理学》[10]介绍的标准进行。

1.3.4 MIC测定 采用试管二倍梯度稀释法测定各组中药复方制剂对大肠杆菌体外的MIC[11]。以浑浊度作指标检测试管中有无细菌生长。阳性对照试管里细菌生长呈浑浊状，阴性对照试管里细菌无生长呈透明状，对照观察其他试管中细菌生长的浑浊状态。因受药物本身颜色影响，试验中无法用肉眼准确判断药物MIC，故改进检测方法，即结合平板接种结果进行判断，琼脂板上如无细菌生长，且是含药液浓度为最低者即为该组中药复方制剂对该细菌的MIC。

（1）临床试验。30 日龄桃源鸡，健康，随机分6 组，每组30只，其中，3组作治疗试验，另外3组作预防保护试验。

（2）治疗试验。除对照组外，其余2组每只鸡胸肌注射菌液0.25 mL，攻菌后中药治疗组每只鸡灌服1.5 mL中药复方制剂水提液，连续5 d。对照组每只注射生理盐水1 mL，统计鸡只存活数和保护率。

（3）预防保护试验。每只鸡每次灌服0.75 mL中药复方制剂水提液，连续9 d；对照组每只注射生理盐水1 mL。灌服中药复方制剂水提液后第4天和感染组同时每只鸡胸肌注射菌液0.25 mL，对照组不攻菌，不喂药，观察10 d。统计鸡的存活数和保护率。

1.4 数据分析

数据差异显著性检验采用T检验。

2 结果与分析

2.1 体外抑菌试验

由表1可知，当中药复方制剂浓度是1 g·mL-1时，大肠杆菌对复方制剂II和IV呈现高度敏感，抑菌圈直径分别为（18.73±1.66）mm和（17.47±1.37）mm；大肠杆菌对复方制剂III和V呈现中度敏感，抑菌圈直径分别为（12.10±0.75）mm和（13.43±0.25） mm；大肠杆菌对复方制剂I呈现低度敏感，抑菌圈直径为（8.32±0.45）mm。

2.2 MIC测定结果

5 组复方制剂对供试菌MIC呈现出不同程度的抑菌作用。其中，紫地榆、石榴皮和黄连组成的复方制剂II和五倍子、乌梅、黄芩组成的复方制剂IV的抑菌作用明显优于其他组，对大肠杆菌体外抑菌作用较好，MIC分别达0.016，0.008 mg·mL-1；复方制剂III和V对大肠杆菌抑菌作用次之，MIC为0.063 mg·mL-1；复方制剂I抑菌作用最小，MIC为0.500 mg·mL-1，其菌落数随药物浓度升高呈降低趋势。

2.3 治疗试验结果

由表3可知，中药复方制剂II治疗组保护率为80.0%，头孢曲松组为86.6%，对照组自然保护率为26.6%。表明中药复方制剂II能有效控制人工感染致病大肠杆菌的雞发病，明显降低了死亡率。

2.4 预防保护试验

由表4可知，中药复方制剂II对人工感染的鸡大肠杆菌病预防保护作用较好，其保护率为83.3%，与头孢曲松的保护率大小一致。

2.5 人工感染病鸡临床变化

除健康组外，感染后20～24 h，试验组鸡均出现不同程度的临床症状：精神沉郁，食欲减退，呼吸困难，下痢，严重者出现死亡。剖检可见心包膜炎，心包积液；肝脏表面有纤维素性渗出物；气囊浑浊增厚。药物治疗组则症状轻微，剖检病变不明显。

3 讨 论

本试验使用中药水提液测定生药MIC值。由于中药成分复杂，因此其发挥抑菌作用可能是单一成分，也可能是几种成分共同作用的结果[12]。

中药复方经配伍后，具有调节生理活性、调整畜禽机体内环境平衡、促进畜禽生长的功能[13]。本研究配制5 组中药复方制剂水提物，其对大肠杆菌均有较好抑菌作用，且中药复方制剂的抑菌作用均优于单味中药。试验结果表明，复方制剂II与复方制剂IV对大肠杆菌体外抑菌作用最好，MIC分别是0.016，0.008 mg·mL-1；复方制剂III与复方制剂V对大肠杆菌抑菌作用次之，MIC均为0.063 mg·mL-1；复方制剂I抑菌作用最低，MIC为0.500 mg·mL-1。且菌落数随药物浓度升高呈降低趋势。

无论是人工感染还是自然感染的大肠杆菌病，都有发病急、死亡率高的特点，若不能及时治疗，鸡只常很快死亡[14-20]。本试验结果表明，中药复方制剂II与头孢曲松均可有效控制人工感染大肠杆菌后桃源鸡的临床症状，明显降低其死亡率。中药复方制剂II与头孢曲松对大肠杆菌病的治疗率分别为80.0%和86.6%，二者均高于对照组。中药复方制剂II对大肠杆菌病有较好的预防作用，保护率为83.3%，与头孢曲松大小一致。

利用试管二倍梯度稀释法进行抑菌试验，仅能测定中药制剂中是否具有直接抗菌的活性成分或含该抗菌成分活性的大小。因此，中药复方制剂MIC值往往比西药MIC值大。本试验测定的仅是中药复方制剂在体外抑菌作用，当药物进入动物体内后能否达到有效抑菌作用，抑菌效果是加强或减弱，仍需进一步研究。

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