血府逐瘀血清对大鼠背根神经元缺氧损伤的保护作用的研究

刘大凯 王罡 赵钢 迟晓飞

脊髓损伤是周围神经损伤, 是临床常见病之一, 严重影响了人类健康及生活质量, 不同程度的的损伤主要由于外伤所致［1］, 目前临床治疗缺乏特效药物, 加快周围神经再生的速度一直是基础和神经研究工作者的研究目标［2］。血府逐瘀, 汤为活血化瘀中药, 由桃仁、红花、当归、川芎、生地、白芍、丹参、牛膝等构成, 宜疏通督脉, 活血化瘀。有研究显示, 血府逐瘀汤能够使兔实验性颈髓急性损伤神经元周围水肿减轻, 白质肿胀减轻, 有明显微血管再通, 细胞凋亡减少作用［3］。本实验旨在通过研究血府逐瘀汤含药血清对背根神经元的保护作用来探讨血府逐瘀汤的作用机理, 为中医药治疗脊髓损伤提供可靠地理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物 新生24 h的SD大鼠(由实验动物中心提供)10只, 雌雄不限, 体质量为5～8 g。

1.2 主要实验试剂及设备 血府逐瘀血清(医院自行配置)、蛋白酶(GIBCO公司)、高糖型DMEM/F12培养基、NGF(Invitrogen公司)、鼠尾胶(杭州生友生物技术有限公司)、胎牛血清(PAA公司)、逆转录酶-聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂盒［宝生物工程(大连)有限公司］。

1.3 方法

1.3.1 背根神经元分离及培养 在无菌的状态下, 用乙醚将10只大鼠麻醉后, 切开背部皮肤, 打开锥板, 解剖显微镜下取出背根神经, 放于4℃清洗液后, 剪成1 mm3的碎块, 移入0.25%的胰蛋白酶的离心管中, 37℃培养箱中进行消化,消化15 min后向试管中加入FBS终止消化并吹打成细胞悬液, 离心10 min, 离心速度为1000 r/min后弃上清, 加入培养基, 将细胞悬液移入未包被的25 cm2的培养瓶中, 37℃条件下继续培养1 h。取未贴壁细胞悬液于另一离心试管中,调节细胞浓度为2.5×105个/ml, 分别在包被好鼠尾胶原的96孔的细胞板中。24 h后全量换液, 48 h后加入阿糖胞苷,终浓度为2.5 μg/ml, 继续培养背根神经元。

1.3.2 建立细胞损伤模型 将培养5 d的神经元取出, 吸去培养液, 换上亚硫酸钠(浓度为0.3 mol/L)的培养基, 放置在37℃, 5%的CO2的培养箱中继续培养4 h, 复氧2 h后开始按2、6、12、24、48 h时间点收集细胞上清进行相关的实验。

1.3.3 实验分组及药物干预 ①空白对照组：正常培养7 d不进行缺氧损伤；②损伤对照组：建立细胞缺氧损伤模型,在缺氧损伤前24 h给予磷酸缓冲试剂(0.01 mol/L)约10 μl；③空白血清组：建立细胞缺氧损伤模型, 细胞种植3 d后入空血清约10 μl, 1%为最终的浓度；④含药血清组：建立细胞缺氧损伤模型, 在缺氧损伤前24 h均加入含药血清(最佳浓度为1.0×10-10mol/L)约10 μl ；⑤神经营养因子保护组：建立细胞缺氧损伤模型, 在缺氧损伤前24 h均加入NGF (浓度为 1%)约 10 μl。

1.4 观察指标及评价标准 ①MDA的测定：MDA含量=(测定管吸光度-标准空白管吸光度) ×标准品浓度/(标准管吸光度-标准空白管吸光度), MDA可以反映脂质的过氧化程度, 间接反映细胞损伤程度。②SOD的测定：SOD 活力=(对照吸光度值-测定吸光度值)×2×反应体系倍数/对照吸光度值；SOD可以清除超氧阴离子自由基, 保护细胞受损。③LDH的测定：LDH活力=(测定管OD值-测定空管OD值)×标准浓度×2 μmol/ml×1000 ml/(标准管OD值-标准空白管OD值)。LDH生高代表有大量细胞死亡。④MTT法检测细胞的存活率, 存活率=(每组试验组光密度值-空白对照组光密度值)/(阴性对照组光密度值-空白对照组光密度值)×100%；MTT法检测最终产物越少表明细胞死亡或不活跃, 相反说明细胞越活跃。

1.5 统计学方法 采用SPSS20.0统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示, 采用t检验。P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 各组MDA含量比较 空白对照组MDA在各个时间点的变化不大, 损伤对照组是各组中同时间点MDA含量最高的。12 h后MDA含量含药血清组明显低于空白血清组及损伤对照组, 比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；但含药血清组与神经营养因子保护组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

2.2 各组SOD活力比较 空白对照组各个时间点SOD含量变化不大。同时间点含药血清组SOD含量明显高于损伤对照组及空白血清组, 比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；同时间点含药血清组与神经营养因子保护组SOD含量比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

2.3 各组LDH活力比较 损伤后24 h, 含药血清组LDH含量明显低于损伤对照组及空白血清组, 比较差异有统计学意义(P＜0.05), 但与神经营养因子保护组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。见表 3。

表1 各组MDA的含量测定比较(±s, nmol/ml)

表1 各组MDA的含量测定比较(±s, nmol/ml)

注：与含药血清组比较, aP＜0.05

组别 2 h 6 h 12 h 24 h空白对照组 1.268±0.028 1.284±0.076 1.559±0.009 2.003±0.019含药血清组 1.249±0.086 1.279±0.102 1.785±0.043 2.865±0.006空白血清组 1.268±0.072 1.320±0.056 2.236±0.072a 3.698±0.048a损伤对照组 1.456±0.069 1.782±0.089 2.863±0.059a 3.765±0.037a神经营养因子保护组 1.272±0.043 1.283±0.027 1.630±0.038 2.378±0.081

表2 各组SOD活力比较(±s, U/ml)

表2 各组SOD活力比较(±s, U/ml)

注：与含药血清组比较, aP＜0.05

组别 2 h 6 h 12 h 24 h空白对照组 75.30±3.28 70.24±2.08 68.68±3.37 65.45±3.05含药血清组 60.94±3.08 52.24±3.10 38.89±3.39 31.69±3.49空白血清组 41.20±2.32a 26.01±3.25a 20.19±2.01a 18.76±3.95a损伤对照组 35.92±3.69a 22.63±3.01a 18.56±2.89a 16.97±3.23a神经营养因子保护组 62.75±4.82 53.35±3.61 39.60±3.00 32.56±3.42

表3 各组LDH活力比较( ±s, U/L)

表3 各组LDH活力比较( ±s, U/L)

注：与含药血清组比较, aP＜0.05

组别 24 h 48 h空白对照组 375.30±17.68 487.74±17.08含药血清组 545.34±20.08 892.24±17.90空白血清组 660.20±21.32a 1167.61±23.25a损伤对照组 782.22±20.09a 1152.63±20.01a神经营养因子保护组 489.75±18.84 675.35±20.34

2.4 各组 MTT法检测细胞存活率 空白对照组细胞存活率为(0.624±0.054), 含药血清组细胞存活率为(0.529±0.010),空白血清组细胞存活率为(0.229±0.038), 损伤对照组细胞存活率为(0.221±0.034)、神经营养因子保护组细胞存活率为(0.548±0.056), 含药血清组细胞存活率明显高于空白血清组及损伤对照组, 与神经营养因子保护组及空白对照组较为接近。

3 讨论

脊髓损伤后轴突的再生和修复是医学界的一大难题。近10年间, 一系列作用于不同发病环节的药物已经相继用于动物实验和临床, 其中部分已被证明有减轻或阻止继发损伤、保留和促进脊髓功能恢复的作用［4］。

中药治疗继发脊髓损伤主要以舒筋活血, 扶正固本为主,大致可分为中药复方及中药提取物两大类。在脊髓损伤早期治宜疏通督脉, 活血化瘀。大量研究表明中药三七、丹参、人参、黄芪等有助于改善微循环、抗氧自由基, 减轻脊髓继发性损伤, 抑制成纤维细胞增生, 还可兴奋脊髓, 促进神经细胞和神经纤维的再生［5-10］。

本实验通过测量比较各组MDA含量及SOD、LDH活力, 并采用 MTT法检测细胞的存活率, 观察血府逐瘀血清对大鼠背根神经元缺氧损伤的保护作用, 结果显示, 空白对照组MDA在各个时间点的变化不大, 损伤对照组是各组中同时间点MDA含量最高的。12 h后MDA含量含药血清组明显低于空白血清组及损伤对照组, 比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；但含药血清组与神经营养因子保护组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。空白对照组各个时间点SOD含量变化不大。同时间点含药血清组SOD含量明显高于损伤对照组及空白血清组, 比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；同时间点含药血清组与神经营养因子保护组SOD含量比较差异无统计学意义(P＞0.05)。损伤后24 h, 含药血清组LDH含量明显低于损伤对照组及空白血清组, 比较差异有统计学意义(P＜0.05), 但与神经营养因子保护组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。空白对照组细胞存活率为(0.624±0.054), 含药血清组细胞存活率为(0.529±0.010), 空白血清组细胞存活率为(0.229±0.038), 损伤对照组细胞存活率为(0.221±0.034)、神经营养因子保护组细胞存活率为(0.548±0.056), 含药血清组细胞存活率明显高于空白血清组及损伤对照组, 与神经营养因子保护组及空白对照组较为接近。说明血府逐瘀血清对大鼠背根神经元缺氧损伤具有保护作用, 可以促进神经元的生长。

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