12份白花泡桐材料亲缘关系的ISSR分析

郑兴华++郑正练++丁慧++肖少华++覃子海

摘 要 以‘福桐、‘绿桐2个无性系与10个不同种源的白花泡桐个体为研究对象，采用ISSR分子标记对12份白花泡桐材料的亲缘关系进行研究，并利用DPSv3.01进行聚类分析。结果表明：10条引物共扩增出66条条带，其中有37条多态带，多态性比例为56.1%。根据ISSR聚类分析结果，在遗传距离为0.35时，12份白花泡桐材料可分为5类，第1类为‘福桐无性系与河南、河北种源个体；第2类为‘绿桐无性系与湖南、湖北、江苏种源个体；第3类为浙江、广东种源个体；第4类为江西、福建种源个体；第5类为广西种源个体。此结果可确定‘福桐与‘绿桐为2个不同的无性系。

关键词 白花泡桐 ；亲缘关系 ；简单重复序列区间扩增多态性（ISSR）

中图分类号 S792.43 文献标识码 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.02.009

ISSR Analysis of Relationship of 12 Accessions of Paulownia fortunei

ZHENG Xinghua ZHENG Zhenglian DING Hui XIAO Shaohua QIN Zihai

（Guangxi Futong Forestry Science and Technology Co.， Ltd.， Nanning， Guangxi 530021）

Abstract The genetic relationship of 12 accessions of Paulownia fortunei including two clones‘Fu Tong， ‘Lv Tong clones and 10 individuals of different provenances was analyzed by ISSR data and clustered with DPSv3.01. The results showed that a total of 66 DNA bands were obtained， of which 37 bands were polymorphic and the percentage of polymorphic bands was 0.561. All these accessions could be divided into five groups by ISSR cluster analysis. The first group consisted of clone ‘Fu Tong and individuals of Henan and Hebei provenances； the second group included clone ‘Lv Tong and the individuals of Hunan， Hubei and Jiangsu provenances； the third group the individuals of Zhejiang and Guangdong provenances； the fourth group the individuals of Jiangxi and Fujian provenances； and the fifth group the individuals of Guangdong provenances. It is hence concluded that clones‘Fu Tong and ‘Lv Tong are different.

Keywords Paulownia fortunei ； genetic relationship ； inter-simple sequence repeat

泡桐（Paulownia）為中国最重要的速生优质用材和生态防护树种之一，在中国林业生产和生态环境保护方面一直发挥着不可替代的作用。中国泡桐种质资源分布广泛，种类丰富，仅大陆就有9种2变种和众多变异类型[1]。白花泡桐（Paulownia fortunei）为玄参科（Scrophulariaceae）泡桐属落叶乔木，高达20 m，在中国分布于10多个省（区）。具有耐盐碱、抗性强、对气候适应范围广、生长快、材质优异、生态价值高等特点，为中国中东部地区的重要速生造林树种[2]，具有很大的发展潜力。

为开发利用泡桐资源，国家林业局专门成立了泡桐研究开发中心，收集泡桐优良种质资源，选育泡桐优良无性系，在林分结构、经营密度、干形培育等定向培育方面取得了较大进展。同时以泡桐木材为基材，研发磁控溅射镀膜木材技术，为泡桐木材的利用及增值奠定了基础，有利于整个泡桐产业的提质增效。

除国家层面外，河南、江西、山东、贵州等省份也有泡桐研究及开发利用的相关报告。在广西，目前主推的泡桐品种有‘福桐、‘绿桐等，但其来源地不甚清楚。为此，本研究开展研究摸清其来源，为其造林推广提供参考信息。

ISSR（inter-simple sequence repeat）分子标记是由zietkiewiez等提出的一种新型分子标记，是在SSR（simple sequence repeat）标记基础上发展起来的一种通过半随机性引物进行PCR扩增的技术，可用于检测重复序列之间区域的DNA序列差异[3]。ISSR标记结合了RAPD和SSR的优点，具有模板需要量少、多态性丰富、无需试剂盒、结果记录方便、实验成本低、操作简单、实验稳定性较高等优点[4]。自从发展ISSR标记以来，ISSR已在遗传作图、基因定位、遗传多样性、种群遗传学、种质资源、育种、种质评估、分类学与种系发生学等方面得到了迅速应用，是用于分析物种、种群、不同品系、个体间遗传差异的理想方法，具有广阔的应用前景[5-8]。

本研究将利用ISSR标记对‘福桐、‘绿桐无性系及10个种源的白花泡桐个体进行鉴定及亲缘关系分析，以期为泡桐的资源利用、品种鉴定及知识产权保护提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

12份材料均为白花泡桐，采自广西福桐林业科技有限公司种质资源收集圃。材料的来源地分别为：江西、浙江、河南、福建、广东、湖北、湖南、江苏、河北、广西等10个省（区），每个省（区）采集1个个体，实验的材料还包括绿桐公司的‘绿桐及广西福桐林业科技有限公司的‘福桐2个无性系材料。供试材料见表1。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA的提取

采集新鲜叶片，擦拭干净后，置于自封袋内，放入硅胶干燥处理。称取0.1 g左右的干叶，用Fastprep（Bio101，USA）粉碎，以CTAB法提取每个样本的总DNA[9-10]。

1.2.2 ISSR-PCR反应体系与扩增程序

泡桐的ISSR反应体系为：在25 μL的PCR体系中，包括1×Taq酶缓冲液，1.25 U Taq DNA聚合酶（天根），4种dNTP各0.2 mmol/L，0.4 μmol/L引物，2.0 mmol/L MgCl2，50 ng模板DNA。最佳PCR扩增条件为：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，52℃复性45 s，72℃延伸2 min，共38个循环；循环结束后72℃保存5 min，最后4℃保存[11]。试验设3次重复。

PCR产物在2.0%琼脂糖电泳，按照相同迁移位置上有扩增条带记为“1”、无扩增条带则记为“0”的方法记录每个引物的电泳谱带，将“0”、“1”数据输入Excel表格中，采用UPGMA法，在DPSv3.01统计分析软件中进行聚类分析[12-13]。

2 结果与分析

2.1 ISSR条带和多态性分析

从60对引物中筛选出10条带型清晰、多态性好的引物进行ISSR-PCR扩增，分别为：UBC807、UBC808、UBC809、UBC817、UBC825、UBC828、UBC830、UBC836、UBC846、UBC856。结果显示：10条引物共扩增到66条不同的DNA条带，其中多态性条带有37条，多态性比例为56.1%；每条引物扩增出的ISSR多态性条带在4～12间，平均每条引物能扩增出3.7条多态性条带；扩增片段大小在100～2 000 bp。引物UBC807、UBC830的电泳结果见图1。

2.2 12份白花泡桐ISSR聚类分析

按Nei和Li（1979）的方法计算遗传距离。结果表明，‘福桐无性系和河北种源的个体之间的遗传距离最近，二者的遗传距离为0.12。福建种源个体与‘福桐无性系的遗传距离最远，它们之间的遗传距离为0.739。‘绿桐无性系与湖南种源的个体之间的遗传距离最近（遗传距离为0.131），与江西种源的个体之间的遗传距离最远（遗传距离为0.565）。‘绿桐与湖南、湖北、江苏种源的个体聚为一支，‘福桐与河南、河北種源的个体聚为一支。在遗传距离为0.35时，12份白花泡桐材料可分为5类，第1类为‘福桐无性系与河南、河北种源个体；第2类为‘绿桐无性系与湖南、湖北、江苏种源个体；第3类为浙江、广东种源个体；第4类为江西、福建种源个体；第5类为广西种源个体（图2）。

3 讨论

本研究中的试验材料有10个种源分别来自10个不同的省（区），另有2个未知来源地的无性系材料‘福桐和‘绿桐。结果表明，地理位置相近的种源个体之间的遗传距离也相近，如湖南与湖北、河南与河北、江西与福建、及江西与广西等。但也有少数例外，如浙江与广东种源个体之间的遗传距离小于浙江与福建种源个体之间的遗传距离，这可能由以下2个原因造成：一是每个种源的取样数只有1个，造成的试验或统计上的误差，二是白花泡桐栽培历史悠久，不同种源间的种苗存在相互调拨的情况。

‘福桐和‘绿桐无性系分别为广西福桐林业科技有限公司和绿桐公司选育，近年来在广西、广东、福建、江西、贵州等省（区）大面积推广。通过此研究，确定‘福桐及‘绿桐的来源地，有助于确定其最适宜的栽培及推广区域。‘福桐和‘绿桐无性系间的遗传距离为0.28，在遗传距离为0.35时，‘福桐无性系与河南、河北种源个体聚为一支，‘绿桐无性系与湖南、湖北、江苏种源的个体聚为另外一支。因此‘福桐和‘绿桐为不同的无性系，且来源地不同。

本研究结果为‘福桐和‘绿桐无性系的来源地提供了一定的信息，有利于指导其推广种植。随着白花泡桐扦插及组培技术的成熟[14-15]，白花泡桐的无性系造林得以实现，选用适宜的无性系进行无性系造林将会进一步提高白花泡桐林分的产量。

参考文献

[1] 邓建军，李芳东，乔 杰，等. 白花泡桐优树种质资源收集保存及繁殖技术研究[J]. 中南林业科技大学学报，2011，31（4）：50-55.

[2] 曲金柱，崔 波，马 杰，等. 白花泡桐叶柄愈伤组织再生植株的诱导与培养[J]. 信阳师范学院学报（自然科学版），2006，19（4）：407-410.

[3] 胡绍庆，邱英雄，吴光洪，等. 桂花品种的ISSR-PCR分析[J]. 南京林业大学学报（自然科学版），2004，28（1）：71-75.

[4] 刘海龙，王以红，陈博雯，等. 利用ISSR标记方法鉴定5个桉树优良无性系[J]. 西部林业科学，2011，40（3）：66-68.

[5] 陈永忠，谭晓风，彭邵锋，等. 应用ISSR分析油茶无性系的遗传多样性[J]. 东北林业大学学报，2008，36（6）：19-23，36.

[6] 吴幼媚，刘海龙，王以红，等. 广西种源红锥栽培群体遗传多样性评价[J]. 安徽农业科学，2012，40（3）：1 435-1 436.

[7] 刘海龙，陈晓明，覃子海，等. 红锥、白椎、大叶栎3个树种分子鉴定及亲缘关系的ISSR分析[J]. 安徽农业科学，2011，39（30）：18 419-18

420，18 450.

[8] Zong M， Liu H L， Qiu Y X， et al. Genetic diversity and geographic differentiation in the threatened species Dysosma

pleiantha in China as revealed by ISSR analysis[J]. Biochem Genet， 2008， 46（1）： 180-196.

[9] 李军集，廖和发，刘海龙. 药用植物六角莲基因组DNA提取方法[J]. 广西林业科学，2007，36（2）：89-92.

[10] 覃子海，杨开太，蓝 肖，等. 红锥总DNA提取技术研究[J]. 广西林业科学，2011，40（3）：54-55.

[11] 覃子海，黄金使，刘海龙，等. 桉树的ISSR反应体系建立及优化[J]. 广西林业科学，2007，36（4）：196-198，205.

[12] 唐启义，冯明光. 实用统计分析及其DPS数据处理系统[M]. 北京：科学出版社，2002：185-260.

[13] 刘海龙，马锦林，张日清，等. 11份山茶属植物亲缘关系的ISSR分析[J]. 经济林研究，2012，30（4）：87-90.

[14] 江香梅，戴小英，温 强，等. “桐优 1”等泡桐優良无性系组培高效繁育体系建立[J]. 江西林业科技，2009，37 （2）：11-14.

[15] 李峰卿，曾满生，姚甲宝，等. 泡桐脱毒组培苗生产与容器育苗技术研究[J]. 现代农业科技，2010，22（1）：182-183，189.

① 收稿日期：2016-10-10；责任编辑/黄东杰；编辑部E-mail： rdnk@163.com。

② 郑兴华（1969～），男，工程师，主要研究方向为林业产业开发，E-mail： 525073088@qq.com。

③ 通讯作者：覃子海（1980～），男，高级工程师，主要研究方向为林业生物技术应用，E-mail： 75455621@qq.com。