联合试验设计法优化辣蓼饲料添加剂生产工艺

黄立+宋振涛+朱明军

摘要：辣蓼是一种传统的中药材，来源广泛，具有消炎、镇痛和抗氧化等多种生物活性。使用混料试验和正交试验联合的方式进行了辣蓼饲料添加剂的生产工艺优化，混料试验用于优化麦糟、辣蓼和木薯渣的物料配比，正交试验用于优化黑曲霉、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的接种配比。结果表明，混料试验待优化变量的方差分析均极显著，R2和调整R2均超过90%，模型拟合优秀。选择黄酮含量2.75 mg/g、总酚含量3 mg/g、蛋白质含量28%和蛋白质增量40%作为多重响应的临界条件，得到满足条件的物料配比为麦糟 ∶辣蓼 ∶木薯渣=59 ∶10 ∶31。正交试验的单一效应不显著，使用总数据趋势进行结果分析，得出最佳接种配比为黑曲霉 ∶酿酒酵母 ∶枯草芽孢杆菌=10 ∶10 ∶2，此外除了 2 ∶10 ∶2 接种配比外，其他均达到混料试验的预测结果，完好地验证了混料试验的有效性。最后的验证试验结果表明联合试验设计合理可行。

关键词：辣蓼；混料试验；混合发酵；固态发酵；单细胞蛋白；生产工艺

中图分类号： S188+.4 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）11-0272-05

辣蓼（Polygonum hydropiper Linn.）为一年生草本植物，是中国传统中药材。现代研究表明，辣蓼具有消炎、镇痛和抗氧化等功效[1-2]。传统中药的使用方法常常是热水煎煮法或者直接入药，具有吸收差、有效成分损耗的缺点，而使用现代化的方法（如生物发酵等温和的方式）对辣蓼等传统中药材进行新型研究和开发，将可以很好地弥补这些缺点。

随着世界人口的快速增长，世界食物的供需关系会出现严重的不平衡，因此开发一种廉价而又生产速率快的蛋白质食品就显得更加紧迫，而单细胞（single cell protein）由于具有营养丰富、原料广泛廉价和生产速率高等优点，可以很好地解决这个问题。现代单细胞蛋白生产的研究热点是在工农业废物方面，如废弃柠檬果肉和工业废弃甘油等[3-4]，此举不但可以减少环境污染，而且还变废为宝，可以获得营养收益。

微生物在自然界的生长是一种天然的多菌混合状态，不同菌株之间促进和拮抗作用并存，最后演变为稳定的微生物群落。而混菌发酵（mixed fermentation）就是模拟这种微生物群落的天然生长状态并加以改良，再综合考虑微生物之间的营养和代谢特性，经过人工仔细挑选之后，削弱菌株之间的拮抗作用，而加强菌株之间的互利作用，从而获得微生物发酵的更大收益。Fang等使用里氏木霉和黑曲霉混合发酵的方式进行纤维素酶生产，在优化了菌种配比和延迟接种之后，获得了最大滤纸酶活（FPA）和非常高的β-葡萄糖苷酶活，是所有试验组中最好的纤维素酶活配比[5]。Li等使用黑曲霉和热带假丝酵母混菌发酵中药水飞蓟工业废弃物来生产饲料添加剂，相比较未发酵物料，粗蛋白含量提升了79.85%，活性成分总黄酮、水飞蓟素分别是未发酵物料的2.42、1.63倍[6]。

随着现代研究的发展，试验设计如析因设计、正交试验、Plackett-Burman试验、响应面试验等越来越被研究者所重视。而联合试验设计也因其省时高效的优点受到研究者的青睐，在如今的研究中，Plackett-Burman试验+响应面试验是一种非常常见的试验设计[7-8]，但是广义的联合试验设计远不止如此，根据不同的研究目的，选用不同的联合试验设计，将可以极大地节省试验次数，同时获得很好的试验优化结果。

本研究将根据发酵优化的需要，选用混料试验+正交试验的联合试验设计，对辣蓼混菌发酵生产饲料添加剂进行探索，也为广义的联合试验设计起到借鉴作用。

1 材料与方法

1.1 辣蓼、木薯渣和麦糟

辣蓼由广东省农业科学院兽医研究所提供，高速万能粉碎机（FW 100型，天津泰斯特仪器有限公司）磨碎过200目筛，密封袋包装于室温下存放。

木薯渣来自于广西武鸣安宁淀粉责任有限公司，50 ℃烘干至恒质量，高速万能粉碎机磨碎过40目筛，-20 ℃储存备用。

麦糟来自于广州珠江啤酒集团有限公司，50 ℃烘干至恒质量，高速万能粉碎机磨碎过100目筛，-20 ℃储存备用。

1.2 菌种

酿酒酵母GIM2.121购买自广东省微生物菌种保藏中心（GIMCC），作为单细胞蛋白生产菌。

黑曲霉GIM3.25购买自广东省微生物菌种保藏中心（GIMCC），分离自酒曲中，具有很强的糖化能力。

枯草芽孢桿菌DES-59由华南理工生物科学与工程学院发酵工程研究室保藏，经过紫外和化学联合诱变，高产蛋白酶。

黑曲霉-80 ℃甘油孢子悬液保存。取-80 ℃种子，PDA平板划线，30 ℃静止培养5 d；之后取孢子转接至PDA平板，30 ℃静止培养5 d，10 mL 0.1%吐温80洗孢子，调孢子浓度为105个/mL，即是黑曲霉二级种子液。

酿酒酵母YPD斜面4 ℃保存。取斜面种子1环，接种于YPD液体培养基，30 ℃ 180 r/min振荡培养12 h即得一级种子液；取一级种子液10%（体积分数）接种量接种于YPD液体培养基，30 ℃ 180 r/min振荡培养12 h即得酿酒酵母二级种子液。

枯草芽孢杆菌LB斜面4 ℃保存。取斜面种子1环，接种于LB液体培养基，30 ℃ 180 r/min振荡培养12 h即得一级种子液；取一级种子液10%（体积分数）接种量接种于LB液体培养基，30 ℃ 180 r/min振荡培养8 h即得枯草芽孢杆菌二级种子液。

1.3 混料试验

混料试验设计使用3因素扩大的单纯形重心混料试验设计[9]。

固态发酵参考Li等的方法[6]，根据试验设计表（表1），计算相应的麦糟、辣蓼和木薯渣质量，体系为5 g，准确称量置于150 mL三角瓶中。称量0.05 g/g碳酸钙粉末以中和木薯渣的酸性成分，最终pH值5.0。加入1 mL营养盐溶液，其成分为50 g/L葡萄糖、75 g/L尿素、25 g/L磷酸二氢钾（最终含量为1%葡萄糖、1.5%尿素、0.5%磷酸二氢钾）。调水分为60%，120 ℃灭菌20 min。取黑曲霉、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌种子液等比例混合（1 ∶1 ∶1），无菌条件下接种混合种子液，接种量为30%。于恒温恒湿培养箱中，30 ℃静止培养 96 h。

发酵结束后，于三角瓶中加入50 mL蒸馏水，30 ℃ 180 r/min 振荡提取黄酮1 h，100 mL离心管5 000 r/min离心10 min。上清液2层滤纸抽滤，滤液定容至80 mL，进行总酚、黄酮含量测定。离心沉淀和滤渣合并，置于称量瓶中，105 ℃烘干至恒质量，测定蛋白质含量。

1.4 正交试验

正交试验使用3因素2水平正交试验表（表2）。

在选定的最佳混料配比之下，作不同混菌配比的混菌固态发酵试验发酵体系为5.0 g，其中麦糟2.95 g、辣蓼0.05 g、木薯渣1.55 g，称量0.05 g/g碳酸钙粉末以中和木薯渣的酸性成分，最终pH值5.0。加入1mL营养盐溶液，其成分为50 g/L 葡萄糖、75 g/L尿素、25 g/L磷酸二氢钾。调水分含量为60%，120 ℃灭菌20 min。取黑曲霉、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的种子液，不做混合，根据正交试验设计表，依次接种三者，最后无菌条件下将发酵基质混匀。于恒温恒湿培养箱中，30 ℃静止培养96 h。

发酵完成后，测定黄酮含量、总酚含量和蛋白质含量，操作同混料试验。

1.5 验证试验

在完成上述试验后，综合试验结果得出最佳的试验方案，然后使用验证试验对其可行性和有效性进行验证。准确称量麦糟2.95 g、辣蓼0.05 g、木薯渣1.55 g，体系为5 g，置于 150 mL 三角瓶中。称量0.05 g/g碳酸钙粉末以中和木薯渣的酸性成分，最终pH值5.0。加入1 mL营养盐溶液，其成分为50 g/L葡萄糖、75 g/L尿素、25 g/L磷酸二氢钾（最终含量为1%葡萄糖、1.5%尿素、0.5%磷酸二氢钾）。调水分含量为60%，120 ℃灭菌20 min。取黑曲霉、酿酒酵母、枯草芽孢杆菌的种子液，接种量分别为10%、10%、2%，置于恒温恒湿培养箱中，30 ℃静止培养96 h，3个重复。同时作空白对照试验，不接种种子液，使用无菌水补全，其他操作同上。发酵完成后，测定黄酮含量、总酚含量和蛋白质含量，操作同混料试验。

1.6 参数测定及结果分析

黄酮测定参考张国英的方法[10]；总酚测定使用Folin-Ciocalteu法[11]；蛋白质含量测定使用凯氏定氮法。

试验设计及结果分析使用Design expert 8.0，分析方法均使用方差分析。统计分析使用Minitab 16.0。

2 结果与分析

2.1 混料试验优化物料配比

在无法预先知道最佳物料配比的试验条件下，使用混料试验往往可以非常迅速地获得所有物料配比下的响应变量的变化规律。混料试验是为了找出麦糟、辣蓼和木薯渣三者的最佳混料配比，使用总酚含量、黄酮含量、蛋白质含量和蛋白质增量作为响应变量，测定结果如表1所示。

方差分析结果为总酚含量模型显著性0.000 3，黄酮含量模型显著性0.000 1，蛋白质含量模型显著性0.000 1，蛋白质增量模型显著性0.000 1，均是极显著，且四者的失拟项均不显著，这表明拟合模型具备统计学意义，系统误差很小。4个模型的R2和调整R2均超过90%，表明模型拟合优秀。

图1为四者的等高线图，从总酚含量等高线图（图1-a）可以看出，在麦糟含量较低水平和木薯渣含量较高水平的条件下，总酚含量较低，含量低于2 mg/g；在麦糟高水平的条件下，总酚含量最高，超过4 mg/g。该结论和Meneses等的结论[12]相同，麦糟具较高的总酚含量，80%甲醇提取可以获得6.46 mg/g的总酚含量。在辣蓼较高水平的条件下，其总酚含量介于以上两者之间。这和辣蓼的主要活性成分有关，辣蓼具有高含量的黄酮成分[13]，黄酮是植物总酚成分中含量最大的一类物质[12，14]。

从黄酮含量等高线图（图1-b）可以看出，在木薯渣含量较高的条件下，发酵产物黄酮含量较低，这和木薯渣的主要成分有关，木薯渣具有较高的淀粉含量，可达40.12%[15]，而不含黄酮成分。在麦糟或者辣蓼处于较高水平的条件下，黄酮含量处于较高水平，黄酮最高值可超过4 mg/g，其原因同總酚含量，麦糟和辣蓼具有较高的黄酮成分。

从蛋白质含量等高线图（图1-c）可以看出，在所有的混料配比中，存在一个区域使得发酵产物出现最大蛋白质含量，该区域为麦糟处于较高水平，而辣蓼和木薯渣的总和位于较低水平。这和配比中物料的具体功能有关，麦糟是一种固体发酵介质，同麦麸一样，它的加入可以保持固体发酵基质的疏松性，保证发酵过程中的水分含量和通气性能。而且麦糟的蛋白质含量较高，可以作为氮源，保证发酵的顺利进行。木薯渣的淀粉含量较高，它是发酵的碳源，必须保证木薯渣具有一定的含量，才能提高发酵程度，进而提高蛋白质含量。在蛋白质增量等高线图（图1-d）中，可以清楚地看出木薯渣在发酵过程中的作用，在木薯渣含量较高或者木薯渣和辣蓼总体含量较高的情况下，蛋白质含量增加较高，最大发酵前后的蛋白质增量超过60%。在仅具有麦糟的条件下，没有蛋白质增量，表明发酵无法进行，这和麦糟的成分有关，麦糟是啤酒工业糖化后的工业废弃物，其碳源几乎没有，因此微生物无法直接利用进行生长发酵。

为了综合协调总酚含量、黄酮含量、蛋白质含量和蛋白质增量的变化，使用重叠等高线法来解决多重响应的问题，在Design expert中以黄酮2.75 mg/g、总酚3 mg/g、蛋白质含量28%和蛋白质增量40%为临界等高线绘制重叠等高线，如图2所示，其中的黑色区域为满足黄酮含量超过2.75 mg/g、总酚含量超过3 mg/g、蛋白质含量超过28%和蛋白质增量超过40% 4个限定条件的混料配比值。最后根据Design expert的最优计算， 选择麦糟 ∶辣蓼 ∶木薯渣=59 ∶10 ∶31的配比为最优条件。对于此优化的结果，将于下述正交试验中进行验证。

3.2 正交试验优化菌种配比

在对混料配比进行优化的基础上，对菌种配比进行优化。在混菌发酵中，为了综合协调不同菌株的生长特点，进而尽最大化地提高发酵产物含量或者发酵效果，常常有2个策略[5]：（1）延迟接种：将特定的菌株延迟接种，从而至少保证其中1株菌在前期位于优势菌株地位；（2）菌株配比：将不同菌株的接种量根据需求進行调整，提高需要作为优势菌的菌株接种量，降低需要作为劣势菌的菌株接种量。

本次试验使用3因素2水平正交试验表进行发酵菌株配比的优化，试验结果如表3所示。将黑曲霉、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌分别设置在第1、2、4列，以区分主效应和交互作用。相比较混料试验优化物料配比，之所以使用正交试验来优化接种配比的原因是接种配比对发酵结果的影响较为粗放，很难使用响应面优化或者混料试验一样的试验设计方法来对接种配比进行精确的定量模型分析，而使用正交试验的定性优化在此时会更有意义。

根据Design Expert计算，总酚含量、黄酮含量和蛋白质含量的模型均不显著，不具备统计学效应，因此不再衡量三者的主效应和交互作用。由于正交试验的试验点分布均匀，此时可以使用总数据趋势来对结果进行进一步衡量。正交试验的总数据图如图3所示，以接种配比为横坐标，总酚含量、黄酮含量和蛋白质含量为纵坐标。从图3中可见，除了黑曲霉 ∶酿酒酵母 ∶枯草芽孢杆菌为2 ∶10 ∶2之外，其他接种配比的黄酮、总酚、蛋白质含量均超过了混料试验的预测结果：黄酮含量在2.75 mg/g以上、总酚在3 mg/g以上、蛋白质含量在28%以上，完好地验证了混料试验结果的正确性和有效性。接种配比在2 ∶10 ∶2处时，三者的数值明显低于其他的接种配比，此时的总酚、黄酮、蛋白质含量和其他配比

下的含量值差异明显，这可能和发酵过程中的菌株相互作用有关，在初期酿酒酵母作为优势菌的情况下，酿酒酵母会迅速的利用可发酵糖，从而影响了枯草芽孢杆菌分泌淀粉酶和蛋白酶以及黑曲霉分泌纤维素酶、淀粉酶和糖化酶。根据正交试验结果，在8个接种配比中，接种配比为 10 ∶10 ∶2 时，总酚、黄酮、蛋白质含量最大，因此选择 10 ∶10 ∶2 作为最优的接种配比。

3.3 验证试验

根据混料试验和正交试验的结果，整合最后的最佳发酵条件，并在最佳的发酵条件下，设计验证试验验证最佳发酵条件的可行性和有效性。图4为验证试验各组的黄酮含量、总酚含量和蛋白质含量，从图中可以看出，验证组的黄酮含量、总酚含量和蛋白质含量分别为2.95 mg/g、3.48 mg/g、30.1%，相比较空白对照，黄酮含量提高了111.3%，总酚含量提高42.5%，蛋白质含量提高了26.6%，表明发酵效果显著，混料试验和正交试验的优化结果具备实际意义，完好地验证了联合试验设计思路的有效性和可行性。

3 结论

使用混料试验对麦糟、辣蓼和木薯渣的物料配比进行了优化，4个待优化变量的模型拟合优秀，并找到了满足临界条件黄酮2.75 mg/g、总酚3 mg/g、蛋白质含量28%和蛋白质增量40%的物料配比，其值为麦糟 ∶辣蓼 ∶木薯渣=59 ∶10 ∶31。正交试验用于优化接种配比，根据全数据变化趋势，验证了混料试验结果的有效性和可行性，同时得出了最佳的物料配比为10 ∶10 ∶2。最后在选定的混料配比和接种配比下进行验证试验，试验结果表明，联合试验设计合理可行，验证了2个试验设计所优化的生产工艺的正确性。本试验所研发的辣蓼饲料添加不仅为中药的现代化研究做了探索，而且也为广义试验设计的运用做了新的尝试。

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