人牙髓细胞条件培养液对人牙囊细胞成骨分化作用的体外研究

陶昱 喻金凤 陈军 余勇

从生物学的角度来看，要想实现良好的牙周组织再生需要2 个关键因素：合适的种子细胞和有利的局部微环境。1992 年Wise教授[1]首次发现人牙囊细胞(human dental follicle stem cells, HDFSCs)，大量研究证实HDFSCs可向成骨、成软骨、成脂、成神经方向分化[2-4]，并在适当条件诱导下，HDFSCs可以在体内外形成牙周膜样组织、牙髓牙本质复合体及骨组织[5-6]。经典牙齿发育理论认为，HDFSCs是成牙骨质细胞、牙周膜细胞和成骨细胞的前体细胞，其分别形成牙骨质、牙周膜和牙槽骨，这三者便构成完整的牙周组织[7-8]。同时，有研究证明HDFSCs比牙周膜细胞有更好的分化潜能，所以HDFSCs在牙周组织再生过程中具有巨大的应用前景[9]。在牙齿发育过程中，牙周膜的形成是由包绕成釉器的牙囊和发育中的牙髓共同作用的结果[10]。为了尽可能的模拟牙周膜形成过程中的局部微环境，本实验采用牙髓细胞条件培养液诱导HDFSCs，探讨人牙髓细胞条件培养液(human dental pulp stem cells- conditioned medium，HDPSCs- CM)对HDFSCs成骨分化的作用，以期为牙周组织再生提供一个新的思路。

1 材料与方法

1.1 主要实验仪器及试剂

分选型流式细胞仪(BD influx,美国)；激光共聚焦显微镜(TCS.SP8,Leica，德国);兔抗人波形丝蛋白抗体(Immuno Way,美国)；鼠抗人角蛋白(CK- 14)抗体(Santa Cruz,美国)；鼠抗人CD34、CD73、CD105及Strol- 1抗体(BD Biosciences,美国)；CCK- 8试剂盒(Dojindo,日本)； RNA抽提试剂盒、逆转录试剂盒及Syber Green荧光定量PCR检测试剂盒(Takara,日本)。

1.2 HDFSCs的分离、纯化及培养

HDFSCs来源于因正畸需要拔除的第三磨牙患者，患者签知情同意书，且年龄在18～25 岁之间、无其他系统疾病,牙齿健康、处于牙根发育阶段。取出牙囊组织后采用组织块-消化联合法分离培养 HDFSCs并用单克隆细胞培养方法纯化，第3代细胞用于后续试验。采用免疫荧光方法(波形蛋白和角化蛋白CK- 14)对分离细胞进行来源鉴定。

1.3 HDPSCs- CM的制备

HDPSCs来源同HDFSCs。取得的牙齿在无菌条件下劈开牙冠和牙根，取出牙髓组织，含2%双抗的PBS反复冲洗。其余步骤同HDFSCs。每24 h换液1 次，直至细胞融合约80%时，收集培养液，4 ℃ 5 000 r/min离心10 min，收集上清液，0.22 μm过滤器过滤，加入等量新鲜的含10%FBS的DMEM/F12 1∶1培养液制成HDPSCs条件培养液(HDPSCs- CM)，-80 ℃中储存备用。

1.4 流式细胞术分析

根据抗体说明书，取第3代HDFSCs分别与抗体CD34、CD73、CD105和Stro- 1室温下避光孵育45 min，PBS洗涤重悬后，上机检测分析。

1.5 HDFSCs克隆形成能力检测

取第3代HDFSCs，细胞计数，以1×102的密度接种到100 mm培养皿中，轻轻晃荡，使细胞均匀分布在培养皿中，常规换液，待单个细胞增长到50 个左右时，按照结晶紫染色说明书进行细胞染色，体式显微镜下观察、拍照。

1.6 HDPSCs- CM诱导HDFSCs

取第3代HDFSCs随机分为诱导组和对照组。诱导组加入HDPSCs- CM，对照组加入含10%FBS的DMEM/F12 1∶1培养液，2 组均采用半换液1 次/2 d，倒置相差显微镜观察细胞生长状况及形态学改变。

1.7 CCK- 8检测HDFSCs增殖活性变化

取第3代对数生长期HDFSCs，以2×103/孔的密度接种到96 孔板中，每组设6 个复孔，24 h后，按分组情况加入HDPSCs- CM或对照组培养液，采用CCK- 8进行测定，连续检测7 d。

1.8 成骨诱导培养

取第3代对数生长期HDFSCs，接种于6孔板，密度为2.5×104/孔，按分组情况分别加入HDPSCs- CM或对照组培养液以及成骨诱导培养基。经过7 d和21 d后分别进行ALP染色和茜素红S染色。

1.9 qRT- PCR检测HDFSCs mRNA的表达差异

取第3代HDFSCs以5×104/孔接种到6孔板中，HDPSCs- CM诱导7 d后，根据TaKaRa试剂盒说明书提取总RNA，并进行逆转录，逆转录所得cDNA进行qRT- PCR检测，均采用20 μl反应体系，引物见表 1。实验重复3 次。

表 1 引物信息

1.10 统计学分析

2 结 果

2.1 HDFSCs的分离、培养、鉴定

与以往研究一致[1-3]，与其他间充质来源干细胞一样，HDFSCs具有极强的克隆形成能力(图 1A)，结晶紫染色呈蓝紫色(图 1B)。免疫荧光结果：波形蛋白阳性着色(图 1C)，提示细胞是间充质来源；CK- 14阴性着色(图 1D)，提示分离的HDFSCs无上皮来源。

2.2 流式细胞术结果

结果表明：间充质干细胞表面标志物STRO- 1及CD105阳性，阳性率分别为12.01%和97.02%；淋巴细胞标志物CD73阳性，阳性率为98.70%，造血干细胞表面标志物CD34阴性，只有0.69%(图 2)。

A： 克隆形成； B： 结晶紫染色； C： 波形蛋白表达阳性； D： CK- 14表达阴性

图 2 流式细胞术鉴定HDFSCs表型

2.3 诱导后HDFSCs形态学改变

对照组中HDFSCs始终保持长梭形形态，即使连续培养2 周，其形态也未发生明显变化(图 3)；而在实验组中，经HDPSCs- CM诱导2 周后，HDFSCs逐渐丧失其最初的长梭形形态，呈现出成骨细胞或成牙骨质细胞的短梭形或圆形(图 3)。随着培养时间延长，短梭形或圆形细胞的比例会明显增加。

2.4 诱导后HDFSCs活性的改变

CCK- 8结果示诱导组和对照组的生长曲线趋势均呈“S”型。除第1天，诱导组在每个时间点上HDFSCs活性均低于对照组(P<0.05或P<0.01)(图 4)。

2.5 诱导后HDFCS成骨分化能力的改变

在ALP染色中，诱导组有大量的蓝紫色阳性染色，而对照组则颜色较淡。茜素红S染色的结果显示诱导组的红色矿化结节比对照组染色深而聚集，而对照组矿化结节色淡且较分散(图 5)。

图 4 CCK- 8检测HDFSCs活性

图 5 成骨相关检测

图 6 qRT- PCR检测HDFSCs基因表达

2.6 诱导后HDFSCs基因表达的变化

qRT- PCR检测结果显示：经HDPSCs- CM诱导1周后，诱导组和对照组HDFSCs均表达POSTN、Col- Ⅰ、ALP、BSP和OPN，诱导组相关基因表达均明显高于对照组(P<0.05或P<0.01)(图 6)。

3 讨 论

干细胞的临床应用前景使得干细胞的研究成为21世纪最热门的研究之一。HDFSCs具有与间充质干细胞相似的特征，并且在体外具有向多种细胞系分化的潜能[2-6]。因此，HDFSCs是细胞治疗和组织工程很好的种子细胞。有研究表明，局部微环境在人类多能干细胞的增殖、分化过程中发挥着重要作用[11]。其中局部微环境中产生的生长因子起着主要作用。传统方法中，仅用某些生长因子来模拟其微环境是很难实现完全模拟的，因为这不可能提供全部所需的生物因子。因此，本实验采用HDPSCs- CM诱导HDFSCs的方式来建立牙周膜再生的微环境，为HDFSCs成骨分化提供合适的细胞信号网状通路。

研究表明牙周膜干细胞来源于HDFSCs，表现为类似于外胚间充质来源干细胞的长梭形形态[8,12]。本实验结果证实HDFSCs来源于外胚间充质，且具有干细胞的特征。在HDPSCs- CM诱导下，HDFSCs还可以向类似于成牙骨质或成骨细胞分化，这对牙周再生的实现具有重要的意义，并且将来有望建立成牙骨质或成骨细胞系。尽管仅仅靠细胞形态学的改变并不能判断细胞发生分化，但在对照组中，并没有发现类似的成牙骨质或成骨细胞形态的改变。

细胞增殖活性测定结果显示：HDPSCs- CM诱导后HDFSCs增殖活性明显降低，提示HDPSCs- CM促进HDFSCs分化的同时抑制其增殖活性。这种现象与由于参与这两个过程的双功能调节的存在使得增殖和分化呈负性相关的理念是一致的[13]。

ALP作为成骨细胞分化和功能成熟的早期标志物，在矿化过程中有着关键作用。HDPSCs- CM诱导组的ALP染色较对照组明显。此外钙盐沉积是成骨分化晚期的标志物，通过茜素红S染色发现：相比对照组，HDPSCs- CM诱导组的红色钙盐结节明显。由此说明HDPSCs- CM能促进HDFSCs向成骨方向分化。

本实验还检测了牙周膜相关基因(POSTN、Col- Ⅰ)、成骨相关基因(ALP、BSP、OPN)的表达情况，后者通常被认为是矿化相关基因，特别是牙源性硬组织[14-15]。结果显示，与对照组相比，诱导组中Col- Ⅰ、ALP、BSP和OPN表达明显增强。提示HDPSCs- CM可以诱导HDFSCs成牙骨质或成骨分化。POSTN作为牙周膜的特异性标记基因[16]，在本实验结果中其表达也明显增强，说明经HDPSCs- CM诱导的HDFSCs确实获得了牙周膜干细胞的一些特征。

综上所述，以上实验结果表明经HDPSCs- CM诱导的HDFSCs在体外确实有潜能获取牙周膜干细胞的一些特征，同时还能向成牙骨质或成骨方向分化。HDPSCs- CM提供了其必需的生长因子、生物分子和必要的信号网状通路。然而，关于HDPSCs- CM促进HDFSCs成骨分化的内在机制还需要进一步的研究。