肥胖伴牙周感染小鼠体内B- 1a细胞的表达初探

王轶雄 余挺 谢宝仪 轩东英 章锦才

B- 1a细胞能够分泌抵御病原体入侵的多反应性低亲和力抗体[1-2]，还可以在不受外界刺激的情况下分泌IL- 10、IL- 3等免疫调节分子[3-5]，这些抗体和分子可以在动脉粥样硬化、自身免疫病等炎症疾病的免疫机制中发挥作用。但是尚未有学者对肥胖机体内是否存在B- 1a细胞和其发挥的机制做过相关研究。

牙周炎能够造成牙齿周围组织破坏[6]。有学者发现，牙周炎病损部位有大量B- 1a细胞浸润[7-8]，并在受损的牙龈组织中进一步发现了B- 1a细胞分泌的抗Col- Ⅰ抗体[9-11]。本研究建立肥胖伴牙周感染小鼠模型，应用免疫组化染色、实时定量PCR、蛋白质印迹3 种方法对颌骨与脾脏[12]内的B- 1a细胞膜表面特异性蛋白CD5[13]，及其分泌的抗Col- Ⅰ抗体和IL- 10炎症因子的蛋白表达和mRNA表达情况进行定量分析，从牙周局部到机体脏器，初步探究肥胖与牙周炎、B- 1a细胞三者之间的可能机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料与设备

6 周龄雄性C57BL/6J小鼠(广东省医学实验动物中心)；60%高脂饲料和10%低脂饲料；Real time PCR仪(Mx3000P,Agilent公司,美国)；SDS- PAGE垂直电泳槽(北京凯元伯乐生物科技有限公司)；Image Pro Plus 数字化拍摄系统。

1.2 实验模型诱导

24 只小鼠随机分成2 组，每组12 只。一组喂高脂饲料，为肥胖组(high fat diet，HF)，另一组喂低脂饲料，为标准组(low fat diet，LF)，饲料诱导30 周后[16]，从HF组和LF组中随机抽取6 只做牙周真性结扎处理(牙周炎组，periodontitis，P)，每组剩余的6 只做假性结扎处理(对照组，control，C)，结扎处理5 d[17]，随即产生标准伴牙周假性结扎组(LFC组)、标准伴牙周真性结扎组(LFP组)、肥胖伴牙周假性结扎组(HFC组)、肥胖伴牙周真性结扎组(HFP组)。无菌条件下将上述4组小鼠的脾脏取出，并将其上颌骨分离。

1.3 颌骨免疫组化染色定量分析

对颌骨进行组织处理，抗原热修复后用30 ml/L过氧化氢避光孵育25 min，PBS 5 min×3 次，山羊血清工作液封闭30 min后分别加入IL- 10(小鼠一抗1∶200)(Abcam公司)、CD5(大鼠抗1∶100)(NOVAS公司)、抗Col- Ⅰ抗体(兔抗1∶100)(Abcam公司)4 ℃冰箱过夜；孵二抗(DAKO公司)；显微镜下DAB显色，复染胞核，10%盐酸乙醇分化后透明、脱水、树胶封片，光学显微镜下观察并拍照。用图像处理系统(Image- Pro Plus 6.0)分析图片净光密度值。

1.4 实时定量PCR基因水平检测

将组织在液氮中研磨后加入Trizol试剂提取RNA，逆转录合成cDNA，引物序列见表 1。取1.0 μl的cDNA在20 μl的反应体系中进行实时定量PCR扩增。用甘油醛- 3- 磷酸脱氢酶(GAPDH)作为内参，通过2-△△Ct(△Ct=目的基因Ct-Ctβ-肌动蛋白，△△Ct=△Ct缺氧-△Ct对照，Ct为循环次数)方法检测各基因相对表达量。每个样品均设定5 个平行复孔，取平均值。

1.5 蛋白质印迹法蛋白定量分析

将脾脏组织剪碎，加入裂解液提取总蛋白。经SDS- PAGE电泳分离，转膜。胎牛血清封闭1 h，分别加入IL- 10(小鼠一抗1∶500)、CD5(大鼠抗1∶500)、抗Col- Ⅰ抗体(兔抗1∶20 000)，4 ℃孵育过夜，分别加入相同的二抗(山羊抗兔IgG 1∶20 000)，摇床室温下1 h，PVDF膜后胶片显影，扫描，用凝胶图像处理系统(Image- Pro Plus 6.0)分析条带净光密度值。

1.6 统计学处理

表 1 实时定量PCR目的基因引物序列及长度

2 结 果

2.1 肥胖和牙周炎对颌骨中B- 1a细胞的标记

CD5、抗Col- Ⅰ抗体、IL- 10少量表达于LFC和HFC组的牙龈结缔组织与上皮，但在LFP与HFP组中大量表达。P组中的CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗体表达量显著高于C组(P<0.001)。

P组中LF组的CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗体表达量未显著高于HF组(P>0.05)(图 1～2)。

2.2 颌骨中CD5、抗Col- Ⅰ抗体、IL- 10的mRNA表达

P组中CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗体的mRNA表达量显著高于C组(P<0.001)。

P组中LF组的CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗体的mRNA表达量未显著高于HF组(P>0.05)(图 3)。

2.3 肥胖和牙周炎对脾脏中B- 1a细胞的标记

HF组中CD5表达量显著高于LF组(P<0.001)；IL- 10表达量显著高于LF组(P=0.002)。

抗Col- Ⅰ抗体表达分析显示：在HF组中P组与C组之间的蛋白表达量无统计学差异(P>0.05)，但在LF组中P组蛋白表达量显著高于C组(P<0.05)；在P组中HF组与LF组之间的蛋白表达量无统计学差异(P>0.05)，但在C组中HF组蛋白表达量显著高于LF组(P<0.05)(图 4～5)。

2.4 脾脏中3 种蛋白表达量与体重间的相关性分析

CD5蛋白与体重之间呈显著正相关性(r=0.68,P<0.001)；抗Col- Ⅰ抗体与体重之间呈显著正相关性(r=0.43,P=0.037)；IL- 10与体重之间的相关性不显著(r=0.38,P=0.071)。

图 1 4 组颌骨中CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗体的免疫组化染色结果

图 2 4 组颌骨中CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗体的蛋白表达水平

图 3 4 组颌骨中CD5、抗Col- Ⅰ抗体、IL- 10的mRNA表达水平

图 4 4 组脾脏中CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗体的蛋白印迹 图 5 4 组脾脏中CD5、抗Col- Ⅰ抗体、IL- 10的蛋白表达水平

3 讨 论

本实验发现P组中CD5与抗Col- Ⅰ抗体的蛋白表达量和相关mRNA水平均显著高于C组(P<0.001)。这与前期报道类似[8-9]。虽然之前对2 种蛋白进行过研究，但是研究均为独立的，未曾阐明二者关系。Koutouzis结合B- 1a细胞大量出现在自身免疫患者体内和在牙周病损局部表达显著升高这一事实，认为牙周炎与类风湿性关节炎等自身免疫疾病之间有着类似的病理机制，推测B- 1a细胞是牙周炎局部天然抗体(抗Col- Ⅰ抗体)的分泌细胞[13]。Sugawara[11]发现牙周袋底部和中部的牙龈结缔组织中浸润大量的B- 1a细胞，同时在相应位点的龈沟液中还发现高浓度的抗Col- Ⅰ抗体。本研究虽未对小鼠的龈沟液进行分析(鉴于提取困难)，但通过免疫组化染色发现牙龈结缔组织的中下部，浸润着表达量近似的B- 1a细胞和抗Col- Ⅰ抗体。在动物模型上的这一发现，使得B- 1a细胞与抗Col- Ⅰ抗体之间的关系更清晰明了。

Aramaki[14]表示B- 1a细胞分泌的胶原抗体在牙周炎症局部依旧发挥着对抗细菌和其分泌的内毒素的作用。本实验免疫组化染色中还发现B- 1a细胞除了在牙龈结缔组织中浸润，上皮内也有表达，说明B- 1a细胞阻挡了致病菌初期对牙周组织的破坏，从表达位置的特殊性印证了Aramaki的观点。从HFC组中的相关蛋白及mRNA表达量均高于LFC组中得出，单纯肥胖机体的炎症状态在牙周局部有所体现，并促使B- 1a细胞的增殖。但LFP组中的相关蛋白及mRNA表达量均高于HFP组，说明肥胖对牙周局部炎症产生免疫抑制。Amar[15]曾对此提出免疫耐受理论，认为肥胖环境下的牙周炎症刺激可致使免疫细胞处于抑制状态。此理论虽然针对单核/巨噬细胞提出，但B- 1a细胞与其同为固有免疫，所以免疫耐受理论对这一现象解释更为合理。

本研究对肥胖小鼠脾脏中的CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗体进行定量检测后发现3 种蛋白在肥胖机体内均有不同程度的表达，HF组中CD5和IL- 10表达量显著高于LF组(P<0.05)，并且CD5与抗Col- Ⅰ抗体的表达量随着小鼠体重的增加而不断上调。这不仅说明B- 1a细胞参与了脂肪组织引发的免疫炎症过程，而且在炎症状态中发挥了一定的免疫机制。肥胖环境下牙周感染对脾脏中CD5、IL- 10、抗Col- Ⅰ抗体的表达变化没有起到显著性影响。应该是小鼠5天的牙周急性感染相对于人体牙周炎的慢性发病在病理机制上表现的不同所致。

综上所述，肥胖机体内与牙周炎局部均存在B- 1a细胞并显著表达，但并未发现这两种炎症状态之间存在显著性影响，还需对B- 1a细胞在牙周炎与肥胖病理机制中的作用进行深入探索。