蛋白酶激活受体2活化与缺血后处理对老年糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用*

张秀娥 成 蓓 戚本玲 王 倩

蛋白酶激活受体2活化与缺血后处理对老年糖尿病大鼠心肌缺血再灌注损伤的保护作用*

张秀娥 成 蓓#戚本玲 王 倩

目的：观察缺血后处理(IPost)对老年糖尿病大鼠心肌缺血再灌注(I/R)损伤的影响及蛋白酶激活受体2(PAR-2)活化对其保护作用。方法：老年雄性Wistar大鼠60只，随机选取45只采用链脲佐菌素(STZ)腹腔注射制备老年糖尿病大鼠模型，成模大鼠随机分成3组(每组15只):I/R组、IPost组、PAR-2作用组(PAR-2组)；未行造模的另15只大鼠作为对照组(SC组)。SC组开胸后不结扎，旷置150min；I/R组结扎左冠状动脉前降支30min，再灌注120min；IPost组结扎左冠状动脉前降支30min后，再灌注10s，缺血10s，连续3个循环后，再灌注120min；PAR-2组缺血处理前1h尾静脉注射PAR-2激动剂(SLIGRL-NH2)激活PAR-2，其余处理同IPost组。之后下腔静脉采血，并摘取心脏，分析各组大鼠心肌组织细胞凋亡率、心肌梗死面积、血清超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)浓度的差异。结果：与SC组比较，I/R组心肌梗死面积明显增加(P<0.01),心肌细胞凋亡率和MDA浓度升高(P<0.01)，SOD活性下降(P<0.01)；与I/R组比较，IPost组和PAR-2组心肌梗死面积缩小(P<0.05，P<0.01)，心肌细胞凋亡率和MDA浓度下降(P<0.05，P<0.01)，SOD活性升高(P<0.05,P<0.01)。PAR-2组较IPost组效果更明显(P<0.01)。结论：IPost对老年糖尿病大鼠心肌I/R损伤有保护作用，PAR-2活化可进一步增强此作用；其机制可能与其抑制再灌注诱导的细胞凋亡和氧化损伤有关。

蛋白酶激活受体2；缺血后处理；缺血再灌注损伤；老年糖尿病大鼠；心肌保护

缺血后处理(Ischemic Postconditioning，IPost)可通过激发机体内源性保护机制，减少心肌缺血再灌注(Ischemia/Reperfusion,I/R)损伤，这种缺血后干预方式，已得到许多研究者认可[1,2]，但多集中于成年动物及单纯心肌I/R损伤模型[3]，关于IPost对老年糖尿病大鼠心肌I/R损伤是否有保护作用以及可能机制，鲜有报道，尤其对近年研究发现的蛋白酶激活受体2(Protease-Activated Receptor 2，PAR-2，可减少心肌梗死面积，发挥抗心肌I/R损伤[4])与IPost的作用尚未完全清楚。因此，本研究通过建立老年糖尿病大鼠模型，观察Ipost对其心肌I/R的保护作用及PAR-2活化参与其中的作用效果，为临床老年I/R损伤提供新的治疗靶点。

1 材料与方法

1.1 主要仪器和试剂

H-X小型动物呼吸机(成都泰盟科技有限公司)，心电监护仪(上海玉研科学仪器有限公司)，分光光度计(上海精密科学仪器有限公司)；Image Pro Plus病理图像分析系统和CIAS-1000细胞图像分析仪(北京大恒图像视觉有限公司)；细胞凋亡TUNEL检测试剂盒(武汉博士德生物制品有限公司，批号20140306)；TTC、丙二醛(MDA)及过氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒(南京建成生物工程公司，批号20140213、20140117、20140115)；伊文氏蓝(美国Sigma-Aldrich公司，批号G6975)；链脲佐菌素粉剂(STZ,美国Sigma公司，批号S0084，实验时用枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液配制成1%溶液)，PAR-2激动剂SLIGRL-NH2粉剂(上海生工生物工程技术服务有限公司，批号E5971750001；临用时用双蒸水配制成1mg/ml溶液)。

1.2 实验动物和分组

健康清洁级雄性Wistar大鼠60只，22-24月龄(相当于人类60-70岁)，体重350g-520g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。随机取45只大鼠，禁食12h后一次性腹腔注射1%STZ(60mg/kg)诱导糖尿病模型,72h后禁食4h，断尾取血测血糖，连续3天，其血糖浓度≥16.7mmol/L, 且出现多饮、多食、多尿，提示糖尿病模型复制成功[5]。本次45只大鼠糖尿病模型全部诱导成功。成模大鼠适应性饲养1周后再随机分为缺血再灌注组(I/R组)、缺血后处理组( IPost组)和PAR-2活化组(PAR-2组)，各组均15只。未行造模的另15只大鼠平行注射等量生理盐水，作为对照组(SC组)。

1.3 各组大鼠处理方法

1.3.1 SC组：以1%戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉后行气管切开术，连接呼吸机辅助呼吸，连接心电监护仪检测心电变化，开胸，暴露心脏，在左冠状动脉前降支分支下约2mm处穿一结扎线，但不结扎，旷置150min。

1.3.2 I/R组：结扎前处理同SC组。在左冠状动脉前降支分支下约2mm处穿一结扎线，稳定10min后，结扎左前降支30min造成心肌缺血，心电图出现ST段升高，放松结扎线恢复血流，再灌注120min，至ST段下降50%以上。

1.3.3 IPost组： 同I/R组结扎左前降支，先缺血30min后，再灌注10s，缺血10s，连续3个循环后，再灌注120min，至ST段下降50%以上。

1.3.4 PAR-2组：缺血处理前1h，尾静脉注射SLIGRL-NH2(1mg/kg)，之后处理同IPost组。其它三组在实验前平行注射与本组相同体积生理盐水。

1.4 检测指标和方法

1.4.1 心肌梗死面积测定：再灌注结束后，重新结扎左前降支，同时于尾静脉注入1%伊文氏蓝2ml，30s后迅速取下心脏，剪掉心房及右心室，左心室蓝染区为非缺血区，非蓝染区为缺血区。将心脏置于-20℃冰箱30min，取出后切成厚度约为2mm的薄片5-6片，置入37℃ 的0.1%TTC中孵育20min后取出，坏死心肌呈白色，未坏死心肌呈红色，置入4%甲醛中固定24h，照相后用Image Pro Plus分析系统测量心肌梗死面积。

1.4.2 心肌细胞凋亡检测： 同上结扎左前降支后摘取心脏，留取部分左心室，常规石蜡包埋、切片，按照TUNEL试剂盒说明书进行凋亡细胞检测分析，细胞核中有棕黄色颗粒者为阳性细胞，即凋亡细胞；采用CIAS-1000细胞图像分析系统，每张切片随机选取5个视野，以阳性细胞占细胞总数的百分比作为心肌细胞凋亡率。

1.4.3 SOD活性测定：再灌注末打开腹腔，从下腔静脉抽取静脉血4ml，以4 500r/min离心5min分离血清，-20℃保存。检测前室温复融，取血清样品10μl，采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性，通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂作用下呈紫红色，测定其550nm波长处吸光度，计算总SOD活性。

1.4.4 MDA浓度检测：血液采集及检测前处理同1.4.3。取血清样品0.1ml，采用硫代巴比妥比色法测定MDA浓度，根据过氧化脂质降解产物中的MDA在酸性条件下加热与硫代巴比妥酸缩合形成粉红色化合物，该化合物在532nm处有最大吸收峰，根据此原理测定该处吸光度，计算MDA浓度。

1.5 统计学处理

2 结 果

2.1 各组心肌梗死面积比较

方差分析显示，各组心肌梗死面积差异有统计学意义(P<0.01)。与SC组比较，I/R组心肌梗死面积明显增加(t=-14.236,P<0.01)；与I/R组比较，IPost组心肌梗死面积缩小(t=2.734，P<0.05)；PAR-2组较IPost组缩小更明显(t=6.158，P<0.01)。见表1、图1。

2.2 各组心肌细胞凋亡率比较

方差分析显示，各组心肌细胞凋亡率差异有统计学意义(P<0.01)。与SC组比较，I/R组心肌凋亡率明显升高(t=-8.763,P<0.01)；与I/R组比较，Ipost组下降(t=2.076，P<0.05)；PAR-2组较Ipost组下降更明显(t=15.721，P<0.01)。见表1、图2。

2.3 各组血清SOD活性比较

方差分析显示，各组SOD活性差异有统计学意义(P<0.01)。与SC组比较，I/R组SOD活性显著下降(t=9.108，P<0.01)；与I/R组比较，IPost组SOD活性上升(t=-2.883，P<0.05)；PAR-2组较IPost组升高更明显(t=-7.153，P<0.01)。见表1。

2.4 各组血清MDA浓度比较

方差分析显示，各组MDA浓度差异有统计学意义(P<0.01)。与SC组比较，I/R组MDA浓度显著升高(t=-11.241,P<0.01)；与I/R组比较，IPost组MDA浓度下降(t=2.864，P<0.05)；PAR-2组较IPost组下降更明显(t=5.612，P<0.01)。见表1。

表1 各组检测指标比较均=15)

注：与SC组比较，1)P<0.01 ;与I/R组比较，2)P<0.05 ; 与IPost组比较，3)P<0.01

图1 各组大鼠心肌梗死面积图 (×200，图中箭头所示白色区域为坏死心肌)

图2 各组大鼠心肌细胞TUNEL染色图 (×400，图中箭头所示棕黄色颗粒为凋亡的心肌细胞)

3 讨 论

糖尿病心血管病变是糖尿病危害最大的一种慢性并发症，现实社会中，老年人伴发糖尿病冠心病的发病率逐年升高，严重危害健康和生命。探讨老年糖尿病心肌I/R损伤的病理生理机制及防治策略已成为老年病学研究的热点。目前的许多研究主要在年轻-成年动物/组织模型上进行。由于老年人心肌比年轻人心肌更容易受到缺血性伤害，且老化伴随的心肌改变对各种应激的耐受降低，因而这些结果并不完全适合老年病临床应用研究；只有针对老年对象的研究更能阐述老年患者的临床机制。

IPost是近年发现的一种机体内源性I/R损伤的保护机制，可通过再灌注前给予的短暂缺血/灌注处理显著减轻组织的I/R损伤, 是迄今最有希望应用于临床的减轻再灌注损伤的治疗手段。研究证实，IPost在兔、犬、鼠心肌I/R中具有改善I/R心脏的心功能、缩小心肌梗死面积等作用[6，7]。但其对糖尿病，尤其老年糖尿病心肌I/R损伤是否有保护作用，尚无一致结论或鲜有报道。本研究给予老年糖尿病大鼠IPost后，其心肌细胞凋亡率、心肌梗死面积、MDA浓度明显下降,SOD活性明显升高，显著改善了I/R所致心肌凋亡指数、心肌梗死面积和MDA浓度的升高和SOD活性的下降，证实IPost 通过减轻心肌细胞凋亡、提高细胞抗氧化力对老年糖尿病大鼠I/R损伤有保护作用，与Ma等[8]的研究结果相符。而Oosterlinck等[9]报道IPost使糖尿病大鼠对心肌再灌注损伤的保护作用减弱，与上述结果不一致，主要原因可能与动物年龄、种属及IPost方式、糖尿病模型等不同有关。

PARs属于G蛋白藕联的细胞表面受体超家族成员，能通过特殊的蛋白水解机制活化。PAR-2即胰蛋白酶受体，是该家族成员之一，能够被胰蛋白酶和胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶激活，在心肌I/R损伤中发挥重要作用[10]。SLIGRL-NH2是PAR-2的特异性配体，主要激活PAR-2，通过ERK1/2信号通路发挥保护作用[11]。既往只有PAR-2活化减轻心肌氧化损伤，改善冠脉血流，参与缺血预适应对心肌I/R损伤保护作用的报道[12]，对心肌IPost这种比心肌缺血预适应更有临床应用前景的心肌保护机制以及PAR-2在IPost老年糖尿病大鼠I/R损伤的保护作用目前尚未见报道。本研究在老年糖尿病大鼠IPost前静脉给予SLIGRL-NH2，激活PAR-2，结果显示，该干预可较IPost更进一步减轻老年糖尿病大鼠I/R引起的氧化损伤和心肌细胞凋亡，更进一步提高SOD活性，降低心肌梗死面积，从而加强IPost对老年糖尿病大鼠I/R损伤的保护作用。

综上所述，IPost对老年糖尿病大鼠心肌I/R损伤确有保护作用，PAR-2活化对该作用有增强效果；其机制可能与其抑制再灌注诱导的心肌细胞凋亡和氧化损伤有关，具体信号通路尚需进一步探讨。

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本文第一作者简介：

张秀娥(1974-)，女，汉族，医学博士，主治医师，研究方向为冠心病的病理生理机制

1 Sasaki H, Shimizu M, Ogawa K, et al. Brief ischemia-reperfusion performed after prolonged ischemia (ischemic postconditioning) can terminate reperfusion arrhythmias with no reduction of cardiac function in rats[J]. Int Heart J，2007, 48(2)：205-213.

2 Buchholz B, D Annunzio V，Giani J F, et al. Ischemic postconditioning reduces infarct size through the α1-adrenergic receptor pathway[J]. J Cardiovasc Pharmacol, 2014, 63(6):504-511.

3 He H, Li N, Zhao Z, et al. Ischemic postconditioning improves the expression of cellular membrane connexin 43 and attenuates the reperfusion injury in rat acute myocardial infarction[J].Biomed Rep,2015, 3(5):668-674.

4 Zhong B, Wang DH. Protease-activated receptor 2-mediated protection of myocardial ischemia-reperfusion injury:role oftransient receptor potential vanilloid receptors[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2009,297(6):R1 681-1 690.

5 Jeddi S, Khalifi S, Ghanbari M, et al. Effects of nitrate intakeon myocardial ischemia-reperfusion injury in diabetic rats[J].Arq Bras Cardiol,2016,107(4)：339-347.

6 Zhu J, Yao K, Wang Q, et al. Ischemic postconditioning-regulated miR-499 protects the rat heart against ischemia/reperfusion injury by inhibiting apoptosis through PDCD4[J].Cell Physiol Biochem,2016,39(6):2 364-2 380.

7 Liu ZZ, Kong JB, Li FZ, et al. Ischemic postconditioning decreases matrix metalloproteinase-2 expression during ischemia-reperfusion of myocardium in a rabbit model: A preliminary report[J].Exp Clin Cardiol，2013，18(2):e99-e101.

8 Ma G, AI-Shabrawey M, Johnson JA, et al .Protection against myocardial ischemia/reperfusion injury by short-term diabetes:enhancement of VEGF formation,capillary density, and activation of cell survival signaling[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol,2006,373(6):415-427.

9 Oosterlinck W, Dresselaers T, Geldhof V, et al. Diabetes mellitus and the metabolic syndrome do not abolish, but might reduce, the cardioprotective effect of ischemic postconditioning[J]. J Thorac Cardiovasc Surg,2013,145(6):1 595-1 602.

10 Bucci M, Roviezzo F, Cirino G. Protease-activated receptor-2(PAR2) in cardiovascular system[J]. Vascul Pharmacol，2005，43(4):247-253.

11 Jiang R, Zatta A, Kin H, et al. PAR-2 activation at the time of reperfusion salvages myocardial via an ERK1/2 pathway in in vivo rat hearts[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007,293(5):H2 845-2 452.

12 Napoli C, De Nigris F, Cicala C, et al. Protease-activated receptor-2 activation improves efficiency of experimental ischemic preconditioning[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 2002,282(6):H2 004-2 010.

Protective Effect of Protease-Activated Receptor 2 Activation and Ischemic Postconditioning on Myocardial Ischemia Reperfusion Injury in Aged Diabetic Rats

ZHANG Xiu-e, CHENG Bei#, QI Ben-ling, WANG Qian

Department of Geriatrics, Union Hospital, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022, China；#

Objective: To explore the effect of ischemic postconditioning on myocardial ischemia reperfusion injury in aged diabetic rats and the protective effect of protease-activated receptor 2 (PAR-2) activation on myocardial ischemia reperfusion injury.Method: 60 healthy aged (22-24 months) male Wistar rats were obtained. 45 models of aged diabetic rats were induced by using streptozotocin(STZ) and then the diabetic rats were randomly divided into 3 groups (15 animals in each group):ischemia/reperfusion group(I/R group), ischemic postconditioning group(IPost group) and PAR-2 group. In addition, another 15 rats were saline control group(SC group).The rats in SC group were only subjected to opening the chest but blood vessels were not ligated for 120 minutes. The rats in I/R group were induced by left anterior descending coronary artery occlusion for 30 minutes followed by 120 minutes of reperfusin. The rats in IPost group were treated by left anterior descending coronary artery occlusion for 30 minutes at first. Then left anterior descending coronary artery was released for 30 seconds and occluded for 30 seconds.This was repeated for 3 cycles before the coronary artery was reperfused for 120 minutes. The rats in PAR-2 group were subjected to IPost with further intervention. SLIGRL-NH2 was injected to activate PAR-2 before 1 hour. Difference of myocardial apoptosis, myocardial infarct size and levels of superoxide dismutase(SOD) and malonaldehyde(MDA) were analysed in each group.Results: In comparison with SC group, the myocardial infarct size was markedly increased (P<0.01),the myocardial apoptosis index and the serum levels of MDA were increased (P<0.01), but the serum levels of SOD were reduced (P<0.01) in I/R group. Compared with I/R group, the myocardial infarct size was deereased,the myocardial apoptosis index and the serum levels of MDA were decreased while the serum levels of SOD were increased in IPost group (P<0.05) and in PAR-2 group (P<0.01). The effect in PAR-2 group was more remarkable than that of IPost group(P<0.01).Conclusion: Ischemic postconditioning has protective effect on myocardial ischemia reperfusion injury of aged diabetic rats. The activation of protease-activated receptor 2 can enhance the protective effect. The mechanism may be that myocardial apoptosis and oxidative damage induced by reperfusion were inhibited.

Protease-activated receptor 2; Ischemic postconditioning; Ischemia reperfusion injury; Aged diabetic rats; Cardioprotection

湖北省自然科学基金(2014CKB1018)

华中科技大学同济医学院附属协和医院老年病科/老年医学研究所，武汉 430022；#

，E-mail:yuji5832@163.com

本文2016-12-16收到，2017-01-23修回

R541.4

A

1005-1740(2017)01-0001-05