王静静 姚娅婷 李 阔 郑 永 张 田 王敏康
云南省生物质能与环境生物技术重点实验室,生物能源持续开发利用教育部工程研究中心,云南师范大学生命科学学院(昆明,650500)
以往的研究发现芸豆植物凝集素(KBL)具有凝集精子、抑制受精、抗着床和终止妊娠的作用[1-6],同时具有良好的抗人类免疫缺陷病毒(HIV)的性能[7-8],KBL有望成为一种新型的局部使用的杀微生物剂。从润滑和预防的角度看,凝胶剂剂型是最适宜阴道及肛门使用的:一是润滑作用,可有效减少摩擦的阻力和可能对黏膜造成的损伤;二是附着和覆盖作用,即具有一定隔离和保护阴道或直肠黏膜上皮细胞的作用;三是凝集素可以和HIV外壳的GP120蛋白结合,发挥抑制剂的作用。在避孕方面,KBL可通过直接接触精子发挥制动、杀精或凝集精子的作用而达到避孕的目的。但以往的实验是直接使用不同浓度的植物凝集素溶液进行实验研究,而未使用凝集素制剂。本实验研究包含两部分内容:一是观察不同浓度红芸豆植物凝集素(RKBL)的杀精和凝集精子的效果;二是观察含不同浓度RKBL特别是低浓度的凝胶剂在模拟阴道穹隆结构的“V”型玻璃管中对精子穿透的阻碍作用。为凝胶剂配方筛选和药效学研究提供基础资料。
1.1.1 RKBL凝胶剂RKBL由本实验室从红芸豆中提取。采用双缩脲法测定其蛋白质含量。主要辅料为0.8%的药用级凝胶剂基质—黄原胶,用其配制成RKBL浓度为5,2.5,1,0.5,0.25,0.1,0.05,0.025,0.01,0.005,0.0025,0.001mg/ml的凝胶剂。
1.1.2 精液采用人及犬精子进行实验。人精子为健康人手淫法收集,悬浮于无电解质溶液(EF溶液)[9],4℃保存,1h内使用。犬精子为人工采精,同上述方法保存和使用。
1.2.1 精子凝集实验根据 Sander-Cramer方法[9],取100μl精液分别与500μl的含有5,2.5,1,0.5,0.25,0.1,0.05,0.025,0.01,0.005,0.0025,0.001 mg/ml的RKBL溶液混合,迅速吹打均匀后,在20s内各自取出5μl,在显微镜(100×)下观察,5min后再次观察。若5min后100%的活动精子被凝集,为最终结果,否则在此后每20min观察1次,持续观察3h。实验重复15次。
1.2.2 “V”型管穿透试验取外径1.24mm,内径1.00mm,长30mm的玻璃管若干,用酒精灯加热中部至微红,弯曲玻璃管成90°,制成两臂等长的V型管。取用13只V型管,分别在其底部加入10μl RKBL浓度分别为5,2.5,1,0.5,0.25,0.1,0.05,0.025,0.01,0.005,0.0025,0.001mg/ml的 RKBL凝胶剂及不含RKBL的0.8%的黄原胶,然后在各V型管的两侧管内加入在37℃、5%CO2、饱和湿度的CO2培养箱中预平衡1~2h的人输卵管培养液(HTF)各35μl,最后取5μl的精液分别加入到每支V型管一侧的HTF底部。置于CO2培养箱中,15min后取出观察,之后每隔30min取出观察,持续至3h。实验重复8次。
1.3.1 制动、致死不同浓度RKBL使精子致死及凝集情况。
1.3.2 凝集显微镜(100×)下观察精子凝集及其程度。即精子以头对头,尾对尾以及头对尾的混合型彼此粘连在一起,凝集的精子有一定的活动能力,表现为尾部可以摆动,凝块间未凝集的精子能缓慢向前游动。分为四级[10]:一级(+)为轻度凝集,指每个凝块中<10条精子;二级(++)为中度凝集,指每个凝块有10~15条精子;三级(+++)为大片凝集,指每个凝块有≥50条精子;四级为所有精子凝集,即所有精子彼此相互连接。
1.3.3 “V”型管穿透于显微镜下观察精子穿透凝胶剂的情况,从V型管一侧穿越凝胶剂到达V型管另一侧为穿透成功。
浓度为5,2.5,1mg/ml的RKBL凝胶剂在20s内均能使精子失活,即RKBL浓度≥1mg/ml时,会使精子在20s内失去活动能力,产生制动和致死效应,但不产生凝集现象。而浓度为0.5,0.25,0.1,0.05,0.025,0.01mg/ml的 RKBL凝胶剂均能使精子产生凝集现象。持续且3h以上直到实验结束时仍然保持凝集状态。见表1。总之,实验结果表明:RKBL浓度为0.025mg/ml时,精子凝集>50%,但不致死,表现为尾部可以摆动,并能持续3~4h;浓度0.01mg/ml时,精子部分凝集,且凝集不足50%;0.005mg/ml及其以下浓度的RKBL均不能使精子凝集,表现为精子以较快的速度向前运动,但精子的活动分级受一定影响,其向前运动速度不及其在HTF中的运动速度快。
在 V型管中,RKBL浓度为5,2.5,1,0.5,0.25,0.1,0.05,0.025,0.01,0.005,0.0025和 0.001mg/ml的RKBL凝胶剂及不含RKBL的0.8%的黄原胶均能阻止精子穿透。当凝胶剂中RKBL浓度≥1mg/ml时,精子不仅不能穿透凝胶剂,而且会在凝胶剂附近完全失去活动能力;当RKBL浓度<1mg/ml时,精子具有一定的活动能力,表现为能摆动但不能穿透凝胶剂。见图1。
表1 不同浓度RKBL凝胶各时间点精子凝集程度
图1 精子在有RKBL凝胶的“V”型管中的穿透实验
本实验证明:RKBL 浓度 为 5,2.5,1,0.5,0.25,0.1,0.05,0.025,0.01,0.005,0.0025 及0.001mg/ml的RKBL凝胶剂不仅能有效阻止精子穿透凝胶剂、改变精子运动状态和促使精子凝集,且RKBL浓度≥1mg/ml的凝胶剂能在20s内制动并杀死全部精子,即体外杀精的最低浓度为1mg/ml。此外,关于精子凝集与受精能力方面,WHO的《人类精液检查与实验室处理》(第五版)指出,当50%或更多的活动精子被粘附时,精子宫颈黏液穿透能力和体外受精率受影响,该手册以50%活动精子被粘附(凝集)作为阈值,即当有50%或更多的活动精子被粘附时即可诊断为免疫性不育[10]。笔者认为,RKBL处理精子后的凝集情况与此类似,因此凝集精子的比例也可以作为受精率的判断标准。本实验结果显示,即使 RKBL的浓度降至0.025mg/ml时,精子凝集仍超过50%。这样使得RKBL凝胶剂有较高的避孕有效系数。狭义的杀精子剂应该包括用Sander-Cramer方法试验可有效杀灭精子的制剂,除此之外,还应该包括可促进精子凝集而使之失去受精作用的制剂,即广义的杀精子剂。另外,本实验结果表明,配制RKBL凝胶剂的凝胶剂基质本身也可阻止精子穿透,因此可与RKBL形成良好的协同作用。也就是高浓度的RKBL凝胶液具有杀精作用,中低浓度具有凝集精子的作用,以及凝胶基质本身具有物理屏障、缓释和覆盖作用。
外用杀精剂是在阴道局部发挥其杀精作用的非激素类避孕药物,使用方便,对机体的干扰较小,为人们所乐于接受[11]。多年来,国内外使用最多的外用避孕药为壬苯醇醚(N-9),是目前使用最普遍的一种外用杀精子药[12]。人们曾寄希望N-9用于预防性传播疾病包括预防HIV的传播。但2001年,相关研究已明确,N-9非但不能预防HIV经阴道传播,反而增加了 HIV的感染率[1-2]。2007年12月,美国FDA要求生产商在说明书上添加警告,指明该产品无法预防性传播疾病(包括艾滋病),并且有可能增加感染艾滋病的危险[13]。联合国艾滋病规划署(UNAIDS)和WHO提出,迫切需要研发新的多功能预防技术来保护女性生殖健康。研制兼具避孕和预防AIDS/STDs双功能的外用避孕药物已成为发展趋势和研究热点[14]。在性传播已成为HIV感染和传播的主要途径的今天,研究用于预防包括HIV感染和性传播疾病的阴道和直肠用杀微生物剂具有迫切的需要。相关的研究结果也不断证明KBL在防治HIV及其它病毒性疾病方面的有效性[15-17]。
前期研究证明长期使用2.5mg/ml浓度的RKBL凝胶剂对小鼠阴道上皮细胞无刺激,不会引起阴道细胞破损等不良反应[18]。涂喜庆等[19]实验证明5mg/ml浓度的RKBL制剂对妇女阴道无刺激,不会产生任何不适感。本研究结果看,RKBL凝胶剂中的RKBL浓度在0.025mg/ml时,精子凝集超过50%,也就是说,RKBL凝胶剂在稀释200倍时仍然可以起到有效的避孕作用。众所周知,在实际使用中,凝胶剂进入人体后,由于性行为和体液稀释等因素,浓度可能会发生很大的变化,而RKBL凝胶剂在稀释200倍时仍然有效,表明RKBL凝胶剂具有很高的安全系数和避孕的可靠性。同时,RKBL还可以促进女性阴道内的乳酸杆菌增值,从而恢复和保持女性正常阴道菌群生态。乳酸菌可以防止病原体的入侵,包括导致性传播疾病的艾滋病毒在内[20]。RKBL的浓度为1mg/ml时,能明显促进乳酸杆菌的生长,并且在一定范围内呈现剂量效应依赖性的关系[21]。虽然精子凝集不能完全被证明为不孕的免疫性原因,但是精子凝集能够影响精子的活力程度,而精子活力程度与妊娠有着密切关系[10]。所以含RKBL的凝胶剂作为一种杀精子剂是可行的,具有较好应用前景。
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