纤维素酶辅助粉葛糖化工艺的研究

李妍，林文珍

（肇庆学院化学化工学院，广东肇庆526061）

纤维素酶辅助粉葛糖化工艺的研究

李妍，林文珍

（肇庆学院化学化工学院，广东肇庆526061）

在常规糖化工艺基础上，添加纤维素酶辅助粉葛的糖化。采用单因素试验、正交试验优化得到纤维素酶解的最优工艺条件为：纤维素酶用量为0.6%，酶解温度为55℃，酶解时间为60min，最终糖化液的还原糖含量为8.312 g/100mL，未加纤维素酶处理的糖化液还原糖含量为7.385 g/100mL，说明纤维素酶处理能够改善粉葛糖化的效果。

粉葛；糖化；纤维素酶；还原糖

粉葛是豆科植物甘葛藤的干燥根，主产于广东、广西，四川、云南等地亦产。粉葛口感佳，可药食两用，其功效在于解肌退热、生津止渴、升阳止泻[1]。新鲜粉葛中淀粉含量在20%～25%[2]，通过测定烘干至恒重后的广州食用葛的淀粉含量为（35.46±1.379）%，可溶性糖含量为（16.70%±0.800）%[3]，粗纤维含量在4%～5%[4]。粉葛还含有多种人体必需的氨基酸和铁、钙、锌等微量元素[5]及葛根素等黄酮类物质[6]。以粉葛为原料进行的开发研究主要包括粉葛全粉加工[7]、黄酮含量检测[8]、不同产地成分对比[9]、重金属和微量元素检测[5，10]、贮藏[11]、葛根黄酒[12]、葛根醋饮料[13]研制等。对于粉葛淀粉的研究主要包括淀粉改性[14-15]、酶水解工艺[16]等。黄群等[16]研究了α-淀粉酶和糖化酶协同作用水解葛根淀粉分子，并建立了酶解动力学模型。钟红兰等[17]以超声为辅助手段，利用中温α-淀粉酶对葛根粉进行酶解，通过此方法改善了葛根粉的溶解性。

常规的糖化工艺是采用α-淀粉酶和糖化酶进行处理，为了有效利用粉葛中的淀粉和纤维素，本试验研究应用纤维素酶辅助优化粉葛的糖化工艺，提高粉葛的糖化效率，为进一步开发利用粉葛资源提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料和试剂

粉葛：市售，新鲜产品；α-淀粉酶（活力为2000U/g）、糖化酶（活力为10万U/g，食品级）、纤维素酶（活力为2万U/g，食品级）：均购自南宁庞博生物工程有限公司；食盐：市售；柠檬酸（食品级）：购自南京松冠生物科技有限公司；碘、酒石酸钾钠（分析纯）：上海展云化工有限公司；碘化钾、盐酸、氢氧化钠、硫酸铜（CuSO4· 5H2O）、次甲基蓝、亚铁氰化钾：均为分析纯，广州化学试剂厂；葡萄糖（分析纯）：天津市致远化学试剂有限公司。

1.2 主要仪器

XS-10B 500g多功能粉碎机：东莞布隆鑫机电公司；BS210S电子分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；DHG-9070B数显电热恒温干燥箱：上海浦东荣丰科学仪器有限公司；HH-6恒温水浴锅：苏州金坛市荣华仪器制造有限公司。

1.3 方法

采用相同的液化和糖化工艺，通过加入纤维素酶进行预处理，进而提高糖化效果，对纤维素酶处理的工艺参数进行试验优化。

1.3.1 粉葛的预处理

粉葛粉制备工艺流程为：粉葛→清洗→去皮→切片→护色→烘干→粉碎→粉葛粉。

将粉葛切成长宽2 cm、厚度0.5 cm的小片状，并在护色液（食盐∶柠檬酸∶水=10∶1∶1 000，质量比）浸泡20min～30min[7]，且粉葛片与护色液质量比为1∶3。然后于60℃真空干燥，粉碎备用。

1.3.2 粉葛的糖化

称取粉葛粉10 g于烧杯中，加入100mL水搅拌均匀，配制成100 g/L的乳液，于85℃～100℃下搅拌糊化。采用α-淀粉酶和糖化酶进行粉葛的糖化，加入粉葛粉质量0.4%的α-淀粉酶，于自然pH进行水解，温度为70℃，水解时间为60min，液化期间不断搅拌。然后将液化粉葛浆冷却至60℃，加酸调pH至4.5，加入粉葛粉质量0.4%的糖化酶，糖化时间为2 h。其后煮沸灭酶，冷却过滤，量取1.5mL滤液于100mL容量瓶中稀释至刻度，测定还原糖的含量。

1.3.3 还原糖含量的测定

还原糖含量的测定采用直接滴定法[18]。

1.3.4 纤维素酶用量的单因素试验

称取5份粉葛粉，每份10 g，经糊化后调节其pH值为5.0左右，于55℃水浴锅中，加入纤维素酶的量分别为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%（均为与粉葛粉质量的比例），恒温水浴加热90min，期间要不断搅拌保证酶和样品充分接触。然后按照1.3.2的操作进行粉葛的糖化，通过比较样品滤液的还原糖含量，确定适宜的纤维素酶用量。

1.3.5 纤维素酶作用时间的单因素试验

称取5份粉葛粉，每份10 g，经糊化后调节其pH值为5.0左右，于55℃水浴锅中，加入0.6%（与粉葛粉量的比例）的纤维素酶，恒温水浴加热时间分别为30、50、70、90、110min，期间要不断搅拌保证酶和样品充分接触。然后按照1.3.2进行粉葛的糖化，通过比较样品滤液的还原糖含量，确定适宜的纤维素酶作用时间。

1.3.6 纤维素酶作用温度的单因素试验

称取4份粉葛粉，每份10 g，经糊化后调节其pH值为5.0左右，分别于35、45、55、65℃水浴锅中，纤维素酶加入量为0.6%，恒温水浴加热50min，期间要不断搅拌保证酶和样品充分接触。然后按照1.3.2进行粉葛的糖化，通过比较样品滤液的还原糖含量，确定适宜的酶解温度。

1.3.7 正交试验优化纤维素酶解工艺

针对纤维素酶作用温度、酶解时间、酶用量3个影响因素，以样品滤液的还原糖含量为评价指标，做三因素三水平的正交试验[19]，按照L9（34）正交表安排实验，确定纤维素酶解的最优工艺。

1.3.8 空白试验

准确称取粉葛粉2份，每份10 g，其中一份不添加纤维素酶，直接按照1.3.2的操作进行糖化，另外一份采用纤维素酶的最优工艺处理后，按照1.3.2的操作进行糖化，分别测定2份样品滤液的还原糖的含量，进行对比分析。

2 结果与讨论

2.1 纤维素酶用量的确定

纤维素酶用量与样品滤液还原糖含量的关系见图1。

图1 纤维素酶的用量对粉葛糖化的影响Fig.1 The effect of cellulase dosage on kudzu saccharification

由图1可以看出，当酶用量达到0.6%时，还原糖得率最高，此时的还原糖含量为8.265 g/100mL。原因在于，当纤维素酶浓度达到一定值时，纤维素表面上纤维素酶的吸附达到最大值，反应速度也达到相应的最大值，故继续增加溶液中酶浓度时，还原糖得率也不再提高[20]。因此，确定适宜的纤维素酶用量为0.6%。

2.2 纤维素酶作用时间的确定

纤维素酶作用时间与样品滤液还原糖含量的关系见图2。

由图2可以看出，反应初始还原糖得率逐渐增加，50min时还原糖得率达到最大值，还原糖含量为8.355 g/100mL，后又有所降低，这主要是在反应初期酶解速度较快，随着时间的延长，反应液中还原糖的浓度逐渐增加，产生生成物抑制，同时酶活性随着反应时间的增加逐渐降低。因此，确定适宜的纤维素酶作用时间为50min。

图2 纤维素酶作用时间对粉葛糖化的影响Fig.2 The effect of enzymatic hydrolysis time on kudzu saccharification

2.3 纤维素酶作用温度的确定

纤维素酶作用温度与样品滤液还原糖含量的关系见图3。

图3 纤维素酶的作用温度对粉葛糖化的影响Fig.3 The effect of enzymatic hydrolysis temperature on kudzu saccharification

一般来说，酶的水解反应存在适宜的温度范围，在此范围内，温度的提高有利于纤维素酶活性的提高[21]。由图3可知，纤维素酶处理粉葛的适宜温度是55℃。

2.4 正交试验

根据单因素试验的结果，确定可选择的因素水平为纤维素酶的酶用量（0.5%、0.6%、0.7%）、酶解时间（40、50、60min）、酶解温度（50、55、60℃）[10]。因素水平见表1，正交试验设计及结果分析见表2。

表1 因素水平表Table1 Levels and factors of orthogonal experiment

从表2的极差值（R）可知，影响粉葛糖化的因素主次顺序依次为A＞B＞C，其最优方案为A2B2C3，即酶解温度55℃、纤维素酶量0.6%、酶解时间60min，以此最优方案进行验证试验。

表2 正交试验设计及结果分析Table2 Design and results analysis of orthogonal experiment

2.5 验证试验与空白试验的结果对比

按照纤维素酶解最优方案试验条件进行糖化，同时做不加纤维素酶的空白糖化试验，二者样品滤液的还原糖含量测定结果见表3。

表3 验证试验与空白试验的结果Table3 The results of verification test and blank test

由表3结果可知，验证试验结果试样中还原糖的含量为8.312 g/100mL，空白试验还原糖的含量为7.385 g/100mL，说明纤维素酶对粉葛糖化有一定的辅助作用。这是因为粉葛中含有一定量的纤维素，在纤维素酶的作用下，水解成葡萄糖等还原糖，而且纤维素的适度水解也有利于后续粉葛淀粉的糖化。将最优方案A2B2C3与正交表中最好的第8号试验A3B2C3作对比，其试样中还原糖含量分别为8.312 g/100mL和8.294 g/100mL，显然最优方案的试验结果更好，因此，最终确定A2B2C3为真正的最优方案。

3 结论

通过上述试验结果表明，纤维素酶处理能够改善粉葛糖化的效果。试验得到纤维素酶辅助粉葛糖化的最优工艺条件为：纤维素酶用量为0.6%，酶解温度为55℃，酶解时间为60min，最终糖化液的还原糖含量为8.312 g/100mL，未加纤维素酶处理的糖化液还原糖含量为7.385 g/100mL。

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Study on Saccharification Technology of Kudzu with Cellulase

LI Yan，LIN Wen-zhen
（College of Chemistry and Chemical Engineering，Zhaoqing University，Zhaoqing526061，Guangdong，China）

On the basis of common saccharification process，the saccharification conditions of kudzu was studied by adding cellulase.Using the single factor tests and orthogonal tests，the optimum saccharification conditions were obtained.The kudzu was hydrolyzed by adding 0.6%cellulase to react at 55℃for 60min.The con tent of reducing sugar of saccharification liquid was 8.312g/100mL，while that of the blank test was7.385g/100mL. The results showed that adding cellulase could improve the effect of kudzu saccharification.

kudzu；saccharification；cellulase；reducing sugar

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.019

2016-06-12

广东省高等学校优秀青年教师培养计划资助项目（Yq2013164）

李妍（1978—），女（汉），副教授，博士，研究方向：食品加工技术与应用。