正交设计与响应面法优化山药多糖提取工艺

龙菊，孙翠英，张红霞，王家顺

（安顺学院农学院，贵州安顺561000）

正交设计与响应面法优化山药多糖提取工艺

龙菊，孙翠英，张红霞，王家顺

（安顺学院农学院，贵州安顺561000）

采用微波纤维素酶法提取山药多糖，并利用苯酚一硫酸法测定多糖的含量。在单因素试验的基础上，通过正交试验和响应曲面法进一步优化工艺。结果表明，最佳提取工艺条件为：微波功率662W、酶加量0.2%、酶解时间64min、微波时间50 s，山药多糖提取量为32.42mg/g。

山药多糖；正交试验；响应曲面法

山药，又名薯蓣（Dioscorea japonica Thunb）。山药作为一种食药两用的食品，营养成分全面，含有丰富的碳水化合物和蛋白质。具有增强免疫功能，降血糖、降血脂、抗氧化、抗衰老等多种生理活性，对人体保持健康有重要的意义[1-3]。目前，多糖提取方法有微波辅助法、水提取法、超声波辅助法和纤维素酶解法等，但提取时间较长，提取率较低[4]。为了进一步提高多糖提取率、缩短提取时间。本研究在单因素分析法的基础上，利用正交设计及响应曲面法，并采用微波纤维素酶法提取多糖，为山药多糖提取提供一套快速、高效的方法，为开发山药类功能保健食品提供一定的工艺参数[5-10]。

1 材料与仪器

1.1 材料

山药：安顺刘管新鲜山药。

1.2 试剂

纤维素酶：宁夏和氏璧生物技术有限公司；无水乙醇、浓硫酸、苯酚均为分析纯。

1.3 仪器

AB204-N型电子天平：奥豪斯；752型紫外-可见分光光度计：美国安捷伦；恒温水浴锅：沈阳龙腾仪器有限公司；离心机：上海仪器有限公司；电热恒温干燥箱：上海博讯有限公司；微量移液器：德国Brand；粉碎机：长沙平凡有限公司；微波炉：美的电器；旋转蒸发器：宁波新芝仪器有限公司。

2 方法

2.1 山药多糖提取工艺流程

山药→干燥粉碎→称量→蒸馏水溶解→微波水浴加热→纤维素酶→灭活酶→水浴提取→离心取上清液→浓缩→山药多糖

2.2 山药多糖测定

精确称取山药粉（安顺刘官山药）1.0 g，加入蒸馏水10mL，用600W微波功率处理60 s，后再加入0.2%纤维素酶，在温度50℃条件下酶解1 h，提取结束后抽滤提取液，用浓缩到适当体积。按照苯酚一硫酸法，测定其吸光值，计算山药多糖的含量。

2.3 葡萄糖标准曲线绘制

利用苯酚一硫酸法，在最大吸收波长490 nm处测定葡萄糖吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制标准曲线。标准曲线方程：y=0.013 5x-0.258 3R2=0.999 6。当测定多糖含量时，将吸光值代入标准曲线，即可求出所测溶液的多糖含量。

山药多糖含量的计算公式：

2.4 微波纤维素酶法提取山药多糖单因素试验

通过参考相关文献资料，选取微波法纤维素酶法提取山药多糖提取量有显著影响的4个因素，即微波功率、微波时间、纤维素酶量及酶解时间进行单因素试验，考察每个因子对多糖提取量的影响。

2.5 微波纤维素酶法提取山药多糖多因素试验

2.5.1 正交试验

在单因素试验的基础上，采用正交试验以酶加量、酶解温度、微波功率和微波时间，按L16（44）设计四水平四因素试验，16个组合，3次重复，确定山药多糖的最佳提取方法，试验因子及水平见表1。

表1 试验因子及水平Table1 Testing factors and levels

2.5.2 响应曲面试验

在单因素试验和正交试验（微波时间不显著）的基础上，选用响应曲面试验法，综合考虑做3因素（A微波功率W，B酶加量%，C酶解时间min）3水平共15个试验点的曲面分析试验，响应面分析因素与水平编码表见表2。

表2 响应面分析因素与水平编码表Table2 Factors and levels of response surface experiment

3 结果

3.1 单因素试验结果分析

3.1.1 不同微波功率对山药多糖提取量的影响

通过设定微波时间60 s，纤维素酶加量0.2%，酶解时间1 h，微波功率为160、320、480、600、720、840W，不同微波功率对山药多糖提取量的影响见图1。

图1 微波功率多糖提取含量的影响Fig.1 Microwave power on the influence of the content of the polysaccharide extraction

3.1.2 不同纤维素酶量对山药多糖提取量的影响

通过设定微波功率为600W，微波时间60 s，酶解时间1 h，纤维素酶加量为0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.30%，不同纤维素酶加量对山药多糖提取量的影响见图2。

图2 纤维素酶加量对多糖提取含量的影响Fig.2 Cellulose enzyme concentration on the influence of the content of the polysaccharide extraction

3.1.3 不同纤维素酶酶解时间对山药多糖提取量的影响

通过设定微波功率为600W，微波时间60 s，纤维素酶加量0.2%，酶解时间为20、30、40、50、60、70、80、90min，不同纤维素酶解时间对山药多糖提取量的影响见图3。

图3 纤维素酶反应时间对多糖提取含量的影响Fig.3 Cellulose enzyme digestion time on the influence of the content of the polysaccharide extraction

3.1.4 不同微波功率对山药多糖提取量的影响

通过设定微波功率600W，纤维素酶加量0.2%，酶解时间1 h，微波时间为10、20、30、40、50、60、70 s，不同微波功时间对山药多糖提取量的影响见图4。

图4 微波时间对多糖提取含量的影响Fig.4 Microwave time on the influence of the content of the polysaccharide extraction

利用微波纤维素酶法的单因素试验，分别考察微波功率、维素酶加量、酶解时间和微波时间对山药多糖提取率的影响。由（图1～图4）可知微波功率600W、纤维素酶加量为0.2%、纤维素酶反应时间50min～70min，微波提取时间在30 s～50 s等单因素试验的条件下，山药多糖的提取含量较高。

3.2 微波纤维素酶法提取山药多糖多因素试验

3.2.1 正交试验结果

在单因素试验的基础上，采用正交试验优化山药多糖的提取工艺。其正交试验因素水平及结果分析见表3，方差分析表见表4。

表3 正交试验因素水平及结果分析Table3 Orthogonal test and analysis of results

表4 方差分析表Table4 The variance analysis of the orthogonal trial

由表3可知，对山药多糖提取量影响的因素为微波功率＞纤维素酶加量＞酶解时间＞微波时间。由表4方差分析表可知，微波功率和酶加量极显著，酶解时间有一定影响，微波时间对多糖提取量的影响较小。山药多糖提取工艺的单因素试验与正交试验结果一致，得出最优的工艺组合为10号（A3B2C4D3），微波功率为600W、纤维素酶加量为0.2%、纤维素酶解时间70min和微波时间50 s。

3.2.2 响应曲面试验结果

由单因素试验和正交试验的基础上，利用响应面法优化山药多糖提取工艺。响应面试验分析设计及结果表5，二次回归模型的方差分析结果表6。

表5 响应面试验分析设计及结果Table5 Design and result of response surface analysis

表6 二次回归模型的方差分析结果Table6 Variance analysis of quadratic regression model

通过利用Design expert8.0软件对表5进行回归分析，得到影响山药多糖含量的3因素与响应值的标准二次回归方程模型：

由表6可知，该模型据极显著（P＜0.01），拟合程度好（失拟项P＞0.05），误差小，该模型相关系数R2= 0.999 8＞0.9），表明该模型内部试验点相关。由F值可知，A、B、C、AB、AC、BC、A2、B2、C2极显著。该二次方程能够较好拟合真实的响应面，试验误差小，可以用此模型对山药多糖的提取工艺进行分析和预测。

通过回归方程分析结果作出两因子交互作用的模型响应面图，图直观地反映各因素对响应曲面的影响，微波功率与酶加量的交互作用图5，微波功率与酶解时间的交互作用图6，酶加量与酶解时间的交互作用图7。

图5 微波功率与酶加量的交互作用Fig.5 Interaction between microwave power and enzyme concentration

图6 微波功率与酶解时间的交互作用Fig.6 Interaction between microwave power and enzyme digestion time

图7 酶加量与酶解时间的交互作用Fig.7 Interaction between enzyme concentration and digestion time

微波功率与酶加量（图5）的交互作用对山药多糖提取率影响最大，曲面图比较陡峭；其次是微波功率与酶解时间液料比与提取时间（图6）、酶加量和酶解时间（图7），曲面图相对较平缓，响应面的分析结果与方差分析结果一致。利用design expert软件对试验参数进行典型性分析后，山药多糖最优的提取条件为：微波功率662W、酶加量0.2%、酶解时间64min。在上述优化工艺条件下，经3次重复试验验证山药多糖的提取量达32.42mg/g。

3.3 正交试验与响应曲面试验对比分析

通过正交试验和响应曲面试验，其优化后的工艺参数，两种试验设计优选结果对比见表7。

表7 两种试验设计优选结果对比Table7 Comparison of results between Box-Behnken design and orthogonal design

结果表明，响应曲面法方程显著性比较显著，说明其拟合成度好，能进一步优化山药多糖提取的工艺参数。提高多糖提取含量，符合实际生产，降低生产成本，因此曲面响应法为最佳提取工艺。

4 结论

以山药为研究对象，利用微波纤维素酶法提取山药多糖，在单因素和正交试验的基础上，以山药多糖提取量为指标，采用响应曲面法对山药多糖提取工艺进行优化。与正交试验相比，响应曲面法考虑各因素水平间的交互作用，其稳定性和工作量方面更简易、科学和合理。通过优化的最佳提取条件为：微波功率662W、酶加量0.2%、酶解时间64min、微波时间50 s，山药多糖提取量为32.42mg/g。

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[3]孙锋,谷文英,丁霄霖.山药粗多糖的提取工艺[J].食品与生物技术学报,2006,25(3):79-83

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[5]周梅,王传洲,李再文,等.基于正交及响应曲面设计的自然煤矸地质聚合物配体优化[J].硅酸盐通报,2013,32(7):1258-1263

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Extracting Process Optimization of Yam Polysaccharide by Orthogonal Test and Response Surface Methodology

LONG Ju，SUN Cui-ying，ZHANG Hong-xia，WANG Jia-shun
（College of Agriculture，Anshun University，Anshun 561000，Guizhou，China）

Yam polysaccharide was extraced by microwave-enzyme synergistic method and its content was determined by the method of phenol-sulfuric acid. Orthogonal test and response surface methodology were used to optimize the extraction of yam polysaccharide based on the results of single factor experiments. The results showed that the best extractive technique conditions were as follows：microwave power 662 W，enzyme concentration 0.2 %，enzyme digestion time 64 min，microwave time 50 s. And the content of extracted yam polysaccharide was 32.42 mg/g under the conditions.

yam polysaccharide；orthogonal design；response surface methodology

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.04.012

2016-05-26

贵州省科学技术厅科学技术基金资助项目（No.黔科合J字LKA[2012]05号、黔科合J字LKA[2013]06、黔教科合KY字[2013] 178号）

龙菊（1983—），女（苗），副教授，硕士研究生，研究方向：食品微生物。