常用脑出血动物模型的研究进展

林潇，倪浩棋，黄李洁，诸葛启钏，张宇

（温州医科大学附属第一医院 神经外科，浙江 温州 325015）

·综 述·

常用脑出血动物模型的研究进展

林潇，倪浩棋，黄李洁，诸葛启钏，张宇

（温州医科大学附属第一医院 神经外科，浙江 温州 325015）

脑出血（ICH）的致死致残率很高，严重危及患者生命健康同时影响患者出血后的生活质量，且目前临床上缺乏对其有效的治疗方法。为了对其生理、病理变化进行深入研究，以及评价出血后相应治疗方法的有效性，迫切需要建立能产生稳定血肿且可重复性较好的实验动物模型。笔者通过介绍大、小鼠以及兔、犬等常用动物的ICH模型制作方法及优缺点，为研究者在探寻ICH发病机制、干预方法和药物筛选等过程中选择合适的模型提供参考。

脑出血；动物模型；实验动物；自体血注射法；胶原酶注射法

脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）目前占全部脑卒中发病的10%～20%，依靠目前的循证医学方法，对其有用的治疗手段较少[1]。ICH患者于30 d内死亡的可能性高达35%～52%，且有80%的患者在出血后6个月时生活仍不能自理[2]。ICH的致死致残率很高，且目前治疗中能提升患者生存率以及提高出血后生活质量的较少[3]。因此，构建能够模拟疾病发生发展的动物模型极为重要。笔者通过总结近年来国内外多种文献，概述运用不同动物建模的方法及其发展应用，为以后的研究提供参考。

1 大鼠ICH模型

大鼠模型现今最常使用。人类发生自发性ICH的部位多为基底节区，大鼠也拥有基底节区，其中的尾状核为其脑内最大核团，且容易定位，故多于此定位造模。目前最常用的有以下4种。

1.1 异体血或自体血注射法

1.1.1 单步注射法：该法最早研究且相对简单，早在1982年ROPPER等[4]将27号针头植入大鼠右侧基底节区，同时保持实验动物清醒，并注入0.24～0.28 mL来源于另一大鼠的血液，全程无麻醉，注血速率快。此方法的明显优势是无需使用麻醉，与临床患者发病时清醒状态相似。但其使用异体血液会带来较为严重的炎症反应，同时，输血压力不同于动脉血压，无法模拟人类ICH时动脉压的情况。为克服上述缺点，BULLOCK等[5]于1984年提出在立体定向下使用导管连接股动脉抽血注入的方法，其优点是使用自体血不会引起炎症反应，同时模拟了自身动脉压，高度契合自发性ICH的状况。但模型不易重复，不同动物间来源于自体动脉血造成的血肿体积差异很大。此后，PEELING等[6]发明了通过注射泵来控制注射血液的量和速度产生特定血肿，从而改善该模型的可重复性。他们用25号针头连接注射泵，同时维持压力在100 mmHg，将25 μL的血液在10 s内全部注入到目的区域。为防止血液凝固，注血完毕后针头停留2.5 min再缓慢撤出。他们同时还对比了注射25、50、100 μL血液的差异，发现产生血肿的大小和注血量无关。YANG等[7]也提出了一种类似的方法，他们将股动脉血快速抽入到1 mL的注射器后连于注射泵，然后将100 μL血液迅速注入到大鼠脑内并用胶封堵针孔，并快速拔出针头。这种方法由于注射速率快及拔针过早，易导致血液沿着针道反流、破入侧脑室且溢至硬膜下。但由于方法简便，在改变注射速率后仍有学者使用[8-9]。上述方法都能够模拟临床患者的部分出血后状况，包括血肿的占位效应，以及出血后血液多种有害成分产生的毒性作用等。但是这些模型都不能呈现良好的可重复性，且造成的血肿体积不稳定，成功率较低，同时有出现脑室及硬膜下间隙之间破裂出血和注射的血液返流等情况。

1.1.2 两步注射法：由于单步注射法存在较多的陷，1996年DEINSBERGER等[10]在单步注射法的基础上提出了两步注射法，提高了成功率的同时减少了血液的返流。先注射15 μL自体血，后静置针头7 min，使血凝块形成将针道封堵，再注射余下35 μL。该实验中13例模型仅有1例出现血肿延伸至硬膜下间隙，因此得到了广泛运用，同时被用至小鼠模型上。

1.1.3 套管注射法：BARTH等[11]于2007年提出改良的立体定向下套管定点注射法。该方法将大鼠麻醉后固定于立体定位仪上，在前囟右侧钻孔并将一外套金属微导管的23 G套管插入硬脑膜深度达4 mm，而后通过左右旋转各4次的方法在此处以及4.5 mm和5 mm处重复。此后撤出金属微导管，将30 μL自体血液在5 min内（6 μL/min）匀速注入，注射完毕后停留套管5 min再缓慢撤出。该方法优点为：死亡率低（文献中立即死亡数为0，后续恢复过程中死亡1只）；血肿产生的部位和体积稳定，体积为注入血量的一半即15 μL；微导管旋转所产生的实验误差可以忽略不计，适用于神经移植的研究。

1.2 胶原酶注射法 胶原酶是一种能够水解蛋白的酶，ICH后血肿的扩张以及血管性水肿被认为是局部胶原酶集中释放的结果[4，12]。因此，在ICH单步注射法发展的过程中，因其明显的缺点，部分研究人员发明了使用胶原酶注射来诱导ICH的方法。ROSENBERG等[13]利用微注射泵在9 min内将0.01～0.1 U胶原酶注入大鼠左脑尾状核，出血发生在术后10 min内，同时伴有周围脑组织明显水肿。随后其他研究者对此模型的改进主要为改变注射的位置（改为右侧），以及注射的浓度和速度，再者为改变注射时大鼠是否肝素化。胶原酶注射法的优点在于可模拟人类自发性ICH的同时操作步骤简单。其还能够模仿ICH持续而导致的血肿扩大状态，但不足的是使用胶原酶注射会带来炎症反应，这与临床上患者ICH时无显著可见的炎症反应有较大差别[14]。

1.3 微气囊充涨法 由于注射自体血和胶原酶存在不利因素较多，SINAR等[15]发明了另外一种物理性的方法，即微气囊充涨法。他们于右侧尾状核内插入连接微气囊的25号钝性针头并静置30 min，将微球囊以2.5 μL/s的速率充至50 μL（平均压力控制在13.3 kPa），保留10 min后抽出气体。该模型可通过调节气囊体积，模拟不同的血肿量。不仅能避免针道返流和血液破入脑室、蛛网膜下腔的意外，且能克服血肿大小不稳、形态不一的缺点，更能准确模拟血肿的占位效应。但其无法模拟真实临床环境中患者ICH时病理变化，包括随后的炎症反应、血液成分的溶解、血栓的形成等过程。因此，该法多只用于模拟手术清除血肿的临床状况。

1.4 自发性ICH大鼠模型 除了上述通过人为的技术手段进行造模的方法外，还可以通过特定人工培育技术所培养出的易自发性卒中的大鼠，再通过其自发或者人为手段诱发ICH。最常见的自发性ICH模型有：改变遗传基因获得的易卒中自发性高血压大鼠（spontaneous hyper-tensive rat，SHR）和肾血管性高血压大鼠（renal hyper-tensive rat，RHR）。

1.4.1 SHR：SHR是1963年使用Wistar大鼠培育形成，可自发颅内出血，同时病理过程与人类极为相似。但因饲养不易，易变异和难保种，发生率不稳定，卒中类型难确定，出血时间、出血量及部位无法控制等缺点限制应用[16]。

1.4.2 RHR：RHR是将大鼠肾动脉用特制银夹夹闭，造成狭窄的同时可引发肾性高血压，最终导致ICH。肾动脉夹闭后7 d血压即开始呈现上升趋势，术后3周可使平均动脉收缩压达到150 mmHg，造模10周后引起的脑血管损伤以及血管、微血管的病变与高血压极为相似。但该法成功率偏低，典型者成功率仅达40%～60%。周爽等[17]在此基础上，利用额外注射胶原酶和肝素于脑内使该模型造模时间缩短，同时卒中的类型和出血的部位变得相对恒定，且重复性提高，使实验结果更加稳定可靠。该模型相对廉价，且易于得到，同时造模简单又易于饲养。此类模型缺点与SHR类似。

1.5 不同大鼠ICH模型的比较 在实际应用微气囊充涨法和自发性ICH模型不多见，故以下仅比较最常用的自体血注射法和胶原酶注射法之间的比较。

1.5.1 血肿体积：MACLELLAN等[18]直接对比血液注射法和胶原酶注射法之间的差别。他依照BULLOCK的单步注射法和胶原酶注射法作对比。在完成各成分注射1 h后开始对比血肿的大小。自体血注射模型在前4 h内的血肿体积保持相对稳定，而胶原酶注射的模型在前4 h内血肿体积有明显的增大趋势。随后他通过MRI测量血肿体积和损伤区域发现，早期的血肿体积虽然相近，但是在随后4～6周的恢复阶段，注射胶原酶的模型有更大的病变体积。

1.5.2 功能恢复：MACLELLAN等[19]通过神经功能缺损评分来测定大鼠在2种注射模型中ICH后功能恢复的状况。通过测定实验组在注射血液以及胶原酶后28 d内的评分，发现前者功能恢复好、损伤轻，在21 d时基本可恢复神经功能，而胶原酶组大鼠功能恢复缓慢，第28 d时仍留有神经功能缺陷。

1.5.3 血脑屏障的破坏：MACLELLAN等[19]对比了自体血注射和胶原酶注射所造成的血脑屏障的破坏差异。通过使用MRI图像显示血脑屏障破坏的情况，发现在胶原酶注射后12 h血肿的信号明显增强，而周围边缘组织的信号增强不明显。ICH后血肿和边缘组织的信号于2～4 d内都明显增高。相对于自体血注射法，胶原酶注射对血脑屏障的破坏更加严重。总之，胶原酶注射能够造成更大的脑损害，自体血注射法则在神经功能恢复方面更加良好。

2 小鼠ICH模型

小鼠的ICH模型来源于上述大鼠模型，方法以自体血注射和胶原酶注射为主，与上述相同。

2.1 自体血或异体血注射法 NAKAMURA等[20]将小鼠自体动脉血直接注射到右侧基底神经节进行研究，同时对比注射异体血和0.9%氯化钠溶液所造成的结果，发现异体血将导致更大的脑水肿。

2.1.1 两步注射法：此法改良于大鼠的方法。BELAYEV等[21]在运用套管的基础上试验了两步注射法。先通过立体定位仪将套管置入小鼠左侧纹状体，然后注射5 μL的异体小鼠肝素化的心脏血，停针7 min使血液凝固，再注入余下的10 μL血液，随后静止10 min缓慢退出套管。RYNKOWSKI等[22]在2008年提出了改良后的小鼠两步注射法，通过小鼠尾动脉采集自体血30 μL后在立体定位仪下通过微注射泵以2 μL/min的速度注入5 μL自体血并留针7 min，再继续以2 μL/min的注射速度注入余下的血液，留置插管10 min，随后缓慢撤出。该法所产生的血肿量一致，且在脑水肿和神经评估方面都有良好的一致性和稳定性，适用于出血性卒中的药物和手术治疗的评估，得到了广泛应用。SANSING等[23]在2011年改变了注血量，将15 μL的小鼠自体血分成2份，先以1 μL/min的速度注射7.5 μL，停针5 min后再以同样速率注入余下的血液。上述方法都因注射速率缓慢可避免血液进入脑室内及蛛网膜下腔。

2.1.2 三步注射法：MANAENKO等[24]提出了一种三步注射法。此法所采取的血液来自异体小鼠的静脉血，注射时在最初5 μL注射完后停针7 min（产生血凝块），后再注射5 μL，停留1 min（加强血凝块的形成），随后4 min内注入剩余的20 μL血液。该注射法产生的血肿量较稳定且没有出现返流。

2.2 胶原酶注射法 CHOUDRI等[25]在1997年于大鼠模型的基础上建立小鼠胶原酶注射法模型。他们将1 μL胶原酶在4 min左右全部注入小鼠右侧基底神经节的位置。随后CLARK等[26]在此基础上稍作修改，先在2 min内注射0.5 μL的胶原酶，随后留针3 min，再将余下0.5 μL在2 min内注入，这种方法可以减少针道的返流。

2.3 药物诱导的小鼠高血压脑出血模型 张玲玉等[27]对C57BIM6小鼠定量注射血管紧张素I I和一氧化氮合酶抑制剂后使小鼠产生慢性高血压，再通过后续注射血管紧张素I I可出现高血压性ICH。此法造模简单，创伤小，但出血部位不定及出血量不稳。

2.4 不同小鼠ICH模型的比较 小鼠的不同ICH模型之间的比较与大鼠不同ICH模型之间差异较为相似。KRAFFT等[28]在2012年的实验中对比了小鼠神经功能以及脑水含量在注射自体血和胶原酶后的变化，发现2种方法都能造成较为严重的神经功能损害及脑水肿，后者造成的损害更为严重。

3 兔ICH模型

兔子与灵长类动物有相似的进化史，且具有与人类相似的脑血管形态特征。因此，当发生ICH时，脑血管的生理学和化学变化与人类有很大的相似之处。兔脑体积明显大于鼠脑，便于手术操作和标本收集，更适于神经影像学等方面的研究。

3.1 自体血注射法

3.1.1 单步注射法：KAUFMAN等[29]首次将兔子用于ICH模型研究，他们直接注射自体血液造模，但兔子在注射后短时间内即死亡。发现整个兔脑内可容纳相当于3%～5%脑组织体积的血肿量，该血肿量约为人ICH 50 mL的体积。QURESHI等[30]又对上述方法进行改良，用30 G的针头置入兔的左侧额叶，同时注入自体血，来观察神经元细胞的损伤程度。注血速率的不同对血肿的形成影响很大。张建军等[31]在单步注射法的基础上，比较了快速注血和缓慢注血的差别。他们将2 min内缓慢注入250 μL兔自体血和30 s内快速注入作比较，通过MRI、神经功能评分和病理发现快速注血形成的血肿不规则，缓慢注血所造成的神经功能缺损评分更低（功能损害更严重）且可见大量小胶质细胞及中性粒细胞。

3.1.2 两步注射法：由于两步注射法在大、小鼠身上得到的良好应用以及其优点，也产生了兔的两步注射法。YU等[32]用两步注射法在兔的基底节区注入300 μL自体血成功造模。他们用自制的双层套管（内圈8.5 mm长，直径为25 G；外圈6 mm长，直径为20 G）插入右侧基底节后，然后连接于右侧股动脉和微注射泵。在起初的2 min内匀速注入50 μL自体血，而后调整双层套管和针管，再注入余下的250 μL自体血。该方法的实验存活率达到了93.5%，且未发生破入侧脑室和蛛网膜下腔的意外。该法产生的血肿体积稳定，周围有相应的组织水肿带产生，神经功能损伤较轻且恢复较为迅速。

4 灵长类动物ICH模型

黑猩猩和恒河猴等灵长类动物有90%的DNA和人类相同，且它们的生理结构和大脑构造等都与人类相近，是临床研究中最佳的实验对象。但是此类动物比较珍贵，饲养费用高且困难，因此无法大批量的应用于实验，研究主要集中在自体血注射法。BULLOCK等[33]通过用导尿管连接长尾黑颚猴右侧股动脉以及猴的右侧内囊，使自身动脉血稳定进入到猴的大脑内，并监测ICH后60～90 min局部脑血流量的变化。该方法可减少注射血液所带来的并发症，同时稳定了ICH的压力，使其接近于正常出血时的压力。

ZHU等[34]创造了一种新的注射法。他们在8只食蟹猴的右侧纹状体内注入了1.5 mL的自体血。术前15 min先从右侧股动脉抽取3 mL新鲜动脉血（存于肝素管内），后将麻醉的猴子固定于立体定向架上，将7 G的硬套管插入右侧纹状体内，每5 min注入0.5 mL肝素化的自体血，形成一个小血凝块，至最后一次注射完毕后缓慢撤出针管。在术后12 h内猴子都出现了嗜睡、抑郁情绪以及听觉和感觉受损的状态，同时神经功能缺损明显。MRI检测显示血肿形状规则，在术后4周血肿仍未吸收完全。该模型适合于评估神经功能接受对应治疗后的恢复情况。

5 犬ICH模型

犬易于饲养且犬脑的体积较大，方便手术操作及精细观察生理和病理变化。但犬的饲养价格较高，且来源较少。

5.1 自体血注射法 早在1963年，WHISNANT等[35]就将犬用来研究ICH。他们将0.5～1.5 mL的犬自体血分别注入其脑基底核和深层白质中，能够产生不同体积的颅内血肿。STEINER等[36]完成了真正意义上犬的单步注射法。他们将7.5 mL的犬自体血在动脉压力控制下在20～30 min内注入到犬的基底神经节旁的深层白质内。然而实验过程中出现了小脑幕下疝，因此他们在之后改变了注血的剂量，注入2.8～5.5 mL的自体血，成功构建了犬的ICH模型。LEE等[37]利用注射泵于8 min内将3～5 mL的犬自体血注入到颞叶皮层区，形成了稳定一致的血肿。

5.2 胶原酶注射法 由于犬需要注射的剂量较大因此较少使用。AN等[38]将500 U的细菌胶原酶通过微注射泵在5 min内匀速注入到犬脑的顶叶中，用于测定ICH随时间变化在MRI上的图像改变。

5.3 微气囊充涨法 在1985年TAKASUGI等[39]就利用微气囊植入犬的脑内，将血液注入气囊内充涨气囊，因此减少了直接注血所带来的针道返流现象，同时在实验中发现周围组织的损伤是因脑组织修复时间的延迟，而与血肿大小无关。

5.4 DSA介导下使用导丝的ICH模型 犬的体积相对较大，因此可以使用DSA介入的方法将导丝进入至颅内后刺破血管从而造成ICH。周玉滕等[40]在2005年使用DSA给犬造模，先使用Seldinger法穿刺犬的右股动脉，后在灌注76%泛影葡胺及使用DSA造影的帮助下将导管最终延伸至犬颈内动脉入颅处。此时于导管内置入直头导丝，接着缓慢入颅内约2 cm。通过CT证实导丝顶端位于基底节区或颞叶即可，然后人为快速转动和提插使导丝刺破血管，当术者感到明显突破感时，即表示造模成功。

5.5 超声波引导下穿刺出血 这是一项最新的ICH造模技术，ZHOU等[41]利用超声波对脑血管的显像作用，对构建ICH的出血部位可精确选择，后通过活检针的穿刺作用造模。他们将犬麻醉后固定在平板上，暴露硬脑膜后将超声探头贴于表面，显示大脑的结构及判断血管位置，同时寻找大脑中动脉（middle cerebral artery，MCA）。当在超声图像上发现MCA时，在超声探头的前端连接一个活检穿刺针，同时在超声图像上寻找MCA的最大直径处，用活检针轻轻穿刺该部位，并留针5 min。这种模型能产生稳定一致的结果，各血肿的大小相近，且成功率高。该模型较为简单方便，且定位准确，同时能够模拟真实的出血过程，无需额外注射任何物质（不同于胶原酶和自体血的注射），大有利于探讨新的ICH治疗方法和比较临床干预结果的趋势。

总之，犬的模型现多用于研究脑的MRI成像，以及脑的生理学和外科学干涉治疗。犬的MRI研究多用于探究ICH的急性、亚急性和慢性变化。同时犬脑模型被用来研究脑的生理变化和贫血对脑血流动力的改变[42]，以及细胞的变化和微环境的改变[43]。

6 猪ICH模型

猪脑体积大、白质发达，非常适合ICH的研究，血肿体积较大，便于仔细的检查和研究。主要为自体血注射法，WAGNER等[44]通过注射泵缓慢地将1.7 mL猪血注入到猪的额叶白质中，形成了较为稳定且分布均匀的血肿。KÜKER等[45]通过微气囊将0.5～2 mL的猪静脉血注入到猪的前额叶，减少针道的返流。而后的改良法将18 G的针经术前钻孔处垂直刺入造模位点后去除其内芯，通过股动脉采血1 mL，并利用连接软管的注射器在2 min内先注入0.5 mL动脉血，静止5 min后以相同速率注血2 mL[46]。

7 讨论

不同动物的造模方法主要为血液的注射、胶原酶的注射、气囊的充涨压迫、自发性的动物ICH模型，也有一些新出现的方法如在DSA介入以及利用超声定位准确造模的方法，这些方法经过多年改良大大提高了造模的成功率以及减少了动物的死亡率，且能产生稳定一致、重复性好、精确度高的血肿。自体血注入法与临床患者自发性ICH的过程最类似，可研究脑组织代谢和血流受各种因子的影响过程，以及脑实质出血的病理形态学改变等，为临床治疗提供依据[47]。胶原酶诱导法操作更简便，同时重复性良好，与临床ICH后的病理变化及生化指标改变等有较多相同之处，出血面积大小受控。但因其所致出血以弥漫性出血为主，与真正意义上的出血产生的血肿不同，较为适合研究ICH时血肿和水肿的影响作用等，也可用于药效评价及神经功能恢复状况[48]。微气囊充涨法可模拟血肿的占位效应以及血肿清除后的脑内发生的病理和生理变化、脑血流局部的改变以及颅内压的调节等，因此多用于模拟行手术清除血肿的过程，研究血肿清除术适当的治疗时间窗。至于新产生的DSA介入穿刺造模法以及超声引导下的穿刺造模法等新生方法，有其特定的优点，但仍需经过一定的研究检验和改良。

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（本文编辑：赵翠翠）

R651

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.09.017

2016-10-12

温州市公益性科技计划项目（Y20150042）；浙江省医药卫生重大科技计划项目（WKJ2013-2-022）。

林潇（1991-），男，浙江温州人，硕士生。

张宇，副主任医师，副教授，Email：drzhyu@126.com。