肝组织学评估在非酒精性脂肪性肝病临床研究及实践中的作用

蒋丽娜， 赵景民

(解放军第三〇二医院 病理诊断与研究中心， 北京 100039)

肝组织学评估在非酒精性脂肪性肝病临床研究及实践中的作用

蒋丽娜， 赵景民

(解放军第三〇二医院 病理诊断与研究中心， 北京 100039)

肝活组织检查是非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)，尤其是非酒精性脂肪性肝炎(NASH)诊断的"金标准"，尽管肝穿刺检查存在有创性、取样和评价误差等局限性，但在NAFLD/NASH临床试验研究及新药临床试验中，肝组织学评价是研究队列患者入组、主要治疗终点和(或)次要治疗终点评价的主要评价指标，具有其他方法目前尚不可替代的作用。NAFLD/NASH的组织学评价系统主要包括Brunt系统、美国NASH临床研究网络评分系统、欧洲SAF/FLIP评分系统和儿童NAFLD组织学评分系统，在临床实践和研究中应选择适合的组织学评分系统。

非酒精性脂肪性肝病; 活组织检查, 针吸; 评价研究

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一种常见的慢性肝病[1]，西方国家NAFLD的患病率为17%～36%[2]，在我国为15%～30%[3]。NAFLD包括一系列肝脏疾病，即非酒精性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)以及NASH导致的肝硬化和NAFLD/NASH相关性肝细胞癌[4-7]。欧洲肝病学会(EASL)将NAFLD细分为非酒精性脂肪肝，即单纯性脂肪肝，伴轻度炎症的脂肪肝和早期NASH[即无或轻度(F0～F1)肝纤维化]；NASH肝纤维化，包括具有显著(≥F2)或进展期(≥F3)肝纤维化；NASH导致的早期或肯定的肝硬化(F4)以及肝细胞癌。目前，临床实践中肝活组织检查是诊断NAFLD，尤其是NASH的“金标准”，不但能够明确诊断，而且能够评价炎症活动度和纤维化程度，评估病情，预测疾病进展。在NAFLD/NASH临床研究和新药试验中，鉴于目前影像学检查尚难以评价肝脏炎症坏死程度，实验室检查缺乏特异性血清学诊断标志等，肝穿组织学评价具有重要的地位和作用。目前国际上用于NAFLD/NASH组织学评价系统的适用人群、组织学评价指标、计分方法等存在差异，针对不同的研究目的和研究对象，选择合适的NAFLD/NASH组织学评价系统尤为重要。本文着重对肝活组织检查在NAFLD/NASH临床管理和试验研究中的地位及应用进行评述。

1 肝穿刺活组织检查在临床实践中的适应证及局限性

肝穿刺活组织检查在明确NAFLD/NASH诊断方面具有不可替代的地位，能够确定NAFLD的严重程度(分级和分期)，为治疗和预后提供指导；能够用于NASH自然史研究，明确NASH导致的隐匿性肝硬化。需要注意的是，肝硬化阶段脂肪变性可因脂肪“耗尽”而不易见[8-10]。

关于NAFLD患者肝穿刺适应证的问题,美国肝病学会(AASLD)NAFLD诊治指南中有5项推荐建议:(1)具有NASH和进展期肝纤维化高风险的NAFLD患者，推荐行肝穿刺检查(推荐强度1, 证据级别B);(2)伴有代谢综合征或需要通过NAFLD纤维化评分确定NASH及进展期肝纤维化的高危患者(推荐强度1, 证据级别B)，应行肝穿刺活组织检查[11];(3)疑似NAFLD患者合并其他慢性肝病，推荐肝穿刺活组织检查进行诊断与鉴别诊断(推荐强度1, 证据级别B)[12];(4)疑似NAFLD儿童患者，临床诊断不明或存在多种诊断，或应用潜在肝毒性药物进行治疗前，推荐进行肝穿刺检查(推荐强度1, 证据级别B);(5)儿童患者NASH药物治疗之前，推荐首先行肝穿刺活组织检查以明确NASH诊断(推荐强度2, 证据级别C)[13]。EASL、欧洲糖尿病研究学会和欧洲肥胖症研究学会NAFLD诊治指南中推荐肝活组织检查的建议与AASLD指南中的建议基本相同[14]。

肝活组织检查的主要局限性在于其有创性、取材误差及观察者主观差异。肝活组织检查样本大小对于组织学诊断的准确性至关重要，在临床实践中不可忽视。合格的样本长度至少1.6 cm，宽度1.2 mm～1.8 mm，包含≥10个汇管区，该样本量相当于肝脏的1/50 000。组织样本应置于10%中性福尔马林液固定，石蜡包埋，严格按照病理标准作业程序进行样品处理。基本染色方法包括HE染色、Masson三色染色、Gordon-Sweets网状纤维染色，必要时行铁/铜染色、d-PAS染色、免疫组织化学染色等。

2 NAFLD的组织学特征

脂肪变性是NAFLD的常见的组织学病变，表现为肝腺泡3区为主的不同程度的大泡性脂肪变性、小泡性脂肪变性和大、小泡混合性脂变。小叶炎症(lobular inflammation, LI)是NASH的基本组织学特征之一，包括局灶性炎症坏死、肝细胞凋亡、炎症细胞浸润、脂性肉芽肿/微型肉芽肿和炎性卫星灶等。通常在成人NASH中LI比汇管区炎症(portal inflammation, PI)更明显，若存在显著的PI和淋巴细胞聚集、广泛的界面炎以及丰富的浆细胞浸润时，应与其他慢性肝病鉴别。需要强调的是，肝细胞气球样变是NASH的必备组织学特征。

脂性肉芽肿/微型肉芽肿是由成簇的Kupffer细胞围绕在凋亡的肝细胞或脂滴周围形成的肉芽肿结构。上皮样或干酪样肉芽肿不是NASH的组织学特征，应与其他肝脏疾病进行鉴别诊断。Mallory-Denk小体(Mallory-Denk body, MDB)在NASH病例中较酒精性肝病中少见，泛素蛋白是MDB免疫染色标记，Masson三色染色MDB呈蓝色或绿色。15%～55%的NASH患者中，网状内皮细胞和肝细胞内可出现少量铁沉积。

成人和儿童NAFLD之间存在一些差异[15]。在儿童NASH中，肝细胞脂变不仅限于肝腺泡1区为主的大泡性脂变，有时汇管区周围脂变或全小叶脂变可较明显，PI也较成人NASH表现明显，疾病进展有时较成人NASH更为迅速。

NASH肝纤维化，通常呈现于肝腺泡3区，表现为窦周、细胞周的网格状纤维化。NASH早期窦周或细胞周纤维化较纤细，随着疾病的进展，肝腺泡3区窦周纤维化愈加致密，Masson三色染色或胶原染色能较好显示纤维化分布及程度。桥接纤维化是进展期NASH肝纤维化的特征，包括中央静脉-中央静脉、中央静脉-汇管区、汇管区-汇管区桥接纤维化。肝纤维化进一步发展，可导致肝小叶结构重建，最终可能发生早期和明确的肝硬化。

近年来，慢性HBV感染与NAFLD的关系引起了人们的关注。流行病学资料[16-19]显示，慢性HBV感染NAFLD的发生率为16.3%～37.6%。组织学上，大泡性肝细胞脂肪变性和窦周纤维化是NASH的组织学特征，而弥漫性界面炎和明显的汇管区炎症是慢性乙型肝炎的组织学特征。有报道[20]血清HBV DNA水平与NAFLD呈负相关，有关HBV与肝细胞脂变之间的相互作用机制尚待阐明。

3 NAFLD/NASH的组织学评分

NAFLD/NASH的组织学评价目前常用的有4个定量评分系统。Brunt系统是NASH最基本的评分系统，该系统仅适用于成人NASH；美国NASH临床研究网络(NASH-CRN)评分系统适用于成人和儿童NAFLD，特别适用于临床试验研究或药物验证组织学评价；欧洲SAF/FLIP评分系统适用于成人NAFLD；儿童NAFLD组织学评分系统专门针对儿童NAFLD[21-25]。

在上述4个NAFLD/NASH组织学评分系统中，组织学活动度的分级主要包括脂肪变性、炎症和气球样变。在NASH-CRN评分系统中，NASH活动度(NAS)是脂肪变性、小叶炎症和气球样变积分的总和，代表组织学炎症坏死程度，但每种病变未加权评分，NAS主要用于评估NASH的病变程度，常用于临床研究及药物临床试验研究中的肝组织学评价。纤维化分期从0期到4期，在NASH-CRN中，肝纤维化1期又细分为1a(肝腺泡3区窦周纤细的纤维化)、1b(肝腺泡3区窦周较致密的纤维化)和1c(汇管区周围纤维化)，1a与1b是纤维化分期的递进关系，而1c与1a、1b是早期NASH肝纤维化分布部位的不同。在欧洲肝病指南中，将≥F2定义为显著的肝纤维化,≥F3为进展期纤维化，F4是早期和明确的肝硬化。在SAF /FLIP评分系统中，SAF是脂肪变性、炎症活动度和纤维化程度的加权计分，在临床实践中，SAF评分是NAFLD/NASH诊断的一个较好的评价参数，较NAS评分系统具有可重复性好、准确性高的优点，推荐用于临床NAFLD/NASH组织学诊断。NASH-CRN系统因其病变活动度及纤维化分期较为细致，推荐用于NASH临床研究和新药临床试验中的组织学评价。鉴于儿童NASH中PI通常较成人显著，为此在儿童评分系统中强调PI评分(0～2分)。需要指出的是，NAFLD/NASH组织学诊断与评价不完全依据评分系统，需要结合组织学特征、临床、实验室资料等综合判断或评价。

4 NAFLD/NASH组织学评价在临床研究或新药试验中的应用

AASLD、EASL指南均指出肝活组织检查是NAFLD/NASH临床试验的重要工具之一。临床试验中，NAFLD/NASH组织学评价的地位主要体现在对NAFLD/NASH入组病例进行明确诊断与鉴别诊断,以及初始治疗终点和(或)次要治疗终点的疗效评价方面。

在Elafibranor治疗NAFLD随机双盲临床试验研究IIb期中[26]，分设低剂量和高剂量的Elafibranor治疗组，以及安慰剂对照组。主要治疗终点和次要治疗终点主要是组织学改善。采用NASH-CRN评分系统进行组织学评价。主要治疗终点的评价为NASH逆转[NASH组织学逆转，包括气球样变消失(0分)，小叶炎症消失或持续的轻度LI(0或1分)，组织学诊断为单纯脂肪肝或单纯脂肪肝伴轻度炎症]且无纤维化进展[纤维化进展是指纤维化分期(评分)增加)]。次要治疗终点的评价是与基线水平相比NAS评分降低2分或以上，即脂肪变、肝细胞气球样变、炎症和纤维化组织学评分有所降低。该研究结果显示，高剂量Elafibranor治疗组(120 mg/d，治疗1年)组织学上NASH炎症活动度缓解，纤维化程度未加重。

在法尼醇X受体配体奥贝胆酸治疗NASH的临床试验研究II期(FLINT)(NCT01265498)中[27-28]，设计奥贝胆酸治疗组(25 mg/d，持续72周)和安慰剂对照组，采用NASH-CRN评分系统进行组织学评价。主要治疗终点为NAS评分下降2分或以上，无纤维化进展，完成全程治疗(基线至主要治疗终点)。次要治疗终点是NASH缓解，NAS评分下降，肝细胞气球样变、脂肪变、LI、PI和纤维化的评分有下降。本研究结果显示，奥贝胆酸治疗组较安慰剂组NASH患者组织学有改善，但其长期有效性和安全性待进一步验证。

在吡格列酮、维生素E或安慰剂治疗NASH(NCT00063622)试验[28-29]中，研究设计为NASH受试者分别用吡格列酮、维生素E和安慰剂治疗96周，停止治疗后再进行24周的回访，采用了NASH-CRN评分系统。入组标准为确诊NASH，NAS评分5分及以上；或疑似NASH，NAS评分4分，肝细胞气球样变至少1分。主要治疗终点为：肝细胞气球样变评分下降≥1分；纤维化评分无增加；或NAS评分降至3分以下，或NAS评分至少降低2分，且LI或脂变至少降低1分。次要治疗终点为NASH炎症活动度整体降低，或脂变、LI、气球样变及纤维化评分降低，以及血清转氨酶、人体测量指标、胰岛素抵抗和脂肪分布改善。结果显示，维生素E(800 IU/d)用于治疗非糖尿病NASH成人患者优于安慰剂组，吡格列酮(30 mg/d)治疗组在主要治疗终点较安慰剂组无显著改善，但是在次要治疗终点与安慰剂组相比，较患者获益显著。维生素E和吡格列酮治疗组NASH患者中，AST和ALT水平在治疗初期下降明显 (P值均<0.001)。

5 小结

综上所述，虽然肝活组织检查存在有创性和取样误差等局限性，但目前仍然是诊断NAFLD/NASH的“金标准”，在临床实践中对指导治疗和评价预后具有一定价值。NAFLD/NASH组织学分级、分期系统是NAFLD/NASH临床诊断和试验研究中的有效方法，NASH组织学诊断与评价不仅依赖评分系统，且要兼顾组织学特征。临床试验研究中，NAFLD/NASH组织学评价主要用于NAFLD/NASH入组病例明确诊断与鉴别诊断，及主要治疗终点和(或)次要治疗终点的组织学改善评价方面。

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Roleofhistologicalevaluationoftheliverinclinicalpracticeandresearchonnonalcoholicfattyliverdisease

JIANGLina,ZHAOJingmin.

(PathologicalDiagnosisandResearchCenter, 302HospitalofPLA,Beijing100039,China)

Liver biopsy is currently the gold standard for the diagnosis of nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), especially nonalcoholic steatohepatitis (NASH). Although liver biopsy has the limitations such as invasiveness, sampling error, and evaluation error, in clinical trials of NAFLD/NASH and related new drugs, it is still used to evaluate the enrollment of patients into a cohort and primary and/or secondary endpoints and cannot be replaced by other methods. The histological evaluation systems of NAFLD/NASH mainly include Brunt system, NASH-CRN scoring system, European SAF/FLIP scoring algorithm, and pediatric NAFLD histological scoring system, and an appropriate histological scoring system should be selected in clinical practice and research.

nonalcoholic fatty liver disease； biopsy, needle; evaluation studies

R575.5

A

1001-5256(2017)12-2303-04

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.12.009

2017-11-15；修回日期：2017-11-24。 基金项目：首都卫生发展科研专项项目(首发2014-2-5032)；国家自然科学基金青年项目(81500450)；国家自然科学基金面上项目(81673654) 作者简介：蒋丽娜(1984-)，女，主治医师，博士，主要从事分子肿瘤病理和代谢综合征方面的研究。 通信作者：赵景民，电子信箱: jmzhao302@163.com。

引证本文：JIANG LN, ZHAO JM. Role of histological evaluation of the liver in clinical practice and research on nonalcoholic fatty liver disease[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(12): 2303-2306. (in Chinese)

蒋丽娜，赵景民. 肝组织学评估在非酒精性脂肪性肝病临床研究及实践中的作用[J]. 临床肝胆病杂志, 2017, 33(12): 2303-2306.

(本文编辑：林 姣)