丙泊酚中/长链脂肪乳注射液包封率分析方法的建立

贾国慧+郑建飞

摘 要 目的：建立丙泊酚中/长链脂肪乳注射液包封率的分析方法。方法：利用超滤法分离微乳和游离药物，采用Agilent的XDB-C18作为色谱分离柱、乙腈-水（7∶3）为流动相、检测波长275 nm、柱温25 ℃、流速1.0 ml / min和进样量5 μl进行色谱分析。结果：本方法重复性考察的RSD为1.14%。日间精密度考察RSD为1.25%。结论：所建立的包封率定量方法，简便、快速、重复性好，可作为工艺筛选过程中灵敏、高效、有区分力的监测方法。

关键词 包封率 丙泊酚 微乳 超滤

中图分类号：R944.17 文献标识码：A 文章编号：1006-1533（2017）03-0069-03

Establishment of a method for the determination of propofol entrapment efficiency in a medium and long chain of fat emulsion injection

JIA Guohui*， ZHENG Jianfei

（Central Research Institute， Shanghai Pharmaceuticals Holding Co. Ltd.， Shanghai 201203， China）

ABSTRACT Objective： To establish a method for the determination of propofol entrapment efficiency in a medium and long chain of fat emulsion injection. Methods： The microemulsion and free propofol were separated by ultrafiltration and the high performance liquid chromatography was carried out on an Agilent XDB-C18 column using acetonitrile-water （7：3） as a mobile phase at flow rate of 1.0 ml/min， column temperature 25 ℃ and detective wave length of 275 nm. Results： The RSD for repeatability and inter-day precision was 1.14% and 1.25%. Conclusion： This method is simple， steady and reliable and can be used for the determination of propofol entrapment efficiency in a fat emulsion.

KEy WORDS entrapment efficiency； propofol； microemusion； ultrafiltration

丙泊酚中/長链脂肪乳注射液为我公司开发的脂肪乳制剂，原研为德国费森尤斯卡比（Fresenius Kabi）公司，其产品2007年在我国上市，商品名竟安，为静脉注射用麻醉剂。制剂开发中为了获得与原研一致的药效、安全性及制剂特性，我们选择乳剂的粒径、粒径分布、包封率、外观状态作为考察指标来筛选处方。在这些指标中，反映药物包封程度的包封率是微乳注射剂重要的质量指标，其检测方法的建立也是研究工作中的难点。在参考相关文献的基础上[1-14]，我们尝试了透析法[4-6]、葡聚糖凝胶法[4-7]等方案，均未成功。本研究基于丙泊酚微乳溶液中被包封药物与游离药物粒径的区别，建立了超滤离心检测药物包封率的方法，经实践与验证，所建立的方法操作简单、数据可靠，区分度好。

1 材料与方法

1.1 材料

安捷伦1100型高效液相色谱仪（美国安捷伦）；梅特勒XP56型百万分之一天平（瑞士梅特勒）；Sigma 3K15离心机（德国希格玛）；Millipore Amicon Ultra-4 Ultracel-100k（过滤体积4 ml，NMWL：100 kDal）超滤离心管（德国密理博）；丙泊酚中/长链脂肪乳注射液（批号：20090717-1、100804-5S、100804-10S、100804-15S，公司自制）；费森尤斯卡比（商品名竟安，批号：16DC0082）；丙泊酚长链脂肪乳注射液（商品名力蒙欣，批号：0808261，西安立邦公司）；工作对照品：丙泊酚原料（Product-No：49340790792， NDC 12502-4934-0）。

1.2 高效液相色谱检测方法

1）色谱条件 采用Agilent的XDB-C18（4.6 mm×150mm， 5 μm）作为色谱分离柱；乙腈-水（7∶3）为流动相；检测波长275 nm、柱温25 ℃、流速1.0 ml /min、进样量5 μl。

2）样品制备方法 将超滤离心管（Amicon ultra-4）用50%乙醇水溶液浸泡过夜，待用。取本品0.2 ml于超滤离心管中，加水1.8 ml，20 ℃离心25 min（3 400 g）。下层滤液弃去，上层加水2 ml，机械振荡3 min。以相同条件再次离心25 min，上层液加水1 ml，机械振荡3 min后移至10 ml容量瓶中，并用0.40 ml水清洗2次，清洗液全部转移至10 ml容量瓶中，以四氢呋喃-异丙醇（5∶3）混合液定容。照色谱条件进样测定，计算浓度C。另取本品0.2 ml于10 ml容量瓶中，加四氢呋喃-异丙醇（5∶3）混合液溶解并定容，进样测定，计算浓度C0。包封率（%） =C/C0×100%[14]。

2 结果

2.1 方法的建立与优化

微乳为不稳定体系，包封率测定比较困难，为建立切实可行的控制方法，我们尝试了透析法、葡聚糖凝胶法、超速离心法[8-12]等，结果均不理想。最终，我们在超滤离心法[13]的基础上，经过反复优化，终于获得了操作便利、具有区分力的检测方法。

2.1.1 超滤管的选择

本品属于亚微乳范围，包封药物平均粒径小于300 nm，而游离药物为小分子。基于以上性质及样品的处理量，我们选择了Millipore Amicon Ultra-4 Ultracel-100k的超滤离心管，实践证明所选用的超滤管可有效截留包封药物且可操作性良好。

2.1.2 测定可行性的考察

基于微乳的特性，推测丙泊酚微乳溶液经过超滤离心后，被包封的丙泊酚因为粒径大，会截留在离心管的膜上层，而游离的丙泊酚分子量小，会被甩到膜下层或被吸附到超滤膜上。

取125 μg/ml丙泊酚水溶液2 ml（即250 μg）于超滤管中。超滤离心后移出下层滤液（约2 ml）；上层加水2 ml，涡旋混合3 min。上下层液均取出100 μl于HPLC进样检测。同法操作，离心3次。平行检测2份，结果见表1。

由表1试验结果可知：①超滤膜可吸附大部分的游离丙泊酚，被吸附的游离丙泊酚解吸附量很小（<1%）；②离心2次后，上层几乎不残留游离丙泊酚（<1%）；③鉴于包封率检测为限度检测，中国药典微粒制剂指导原则要求大于80%即可[14]，小于1%的游离药物残留，对检测结果的判定影响不大，因此，所设计的测试方法可行。

2.1.3 离心力的选择

采用20 ℃，25 min条件下对离心力进行筛选，结果见表2。

综上，选择离心条件为3 400 g、20 ℃、25 min，可防止离心后取出上层滤物的困难，又能保证游离丙泊酚基本被分离。

2.2 方法验证

2.2.1 专属性

考察前处理过程对检测是否存在干扰。将超滤管采用50%的乙醇溶液浸泡1 h后，加水、空白微乳、样品，按条件分别处理后，经HPLC检测，空白不干扰样品的测定。

2.2.2 溶液稳定性

考察对照品及样品在配置溶液中的稳定性。分别采用工作对照品及对照品加空白微乳配置约200 μg/ml的溶液，分别考察6～8个时间点至24 h，观察丙泊酚、丙泊酚加空白微乳在样品配置溶液（四氢呋喃-异丙醇5∶3）中的稳定性。经考察，它们RSD实测值均小于1%，符合稳定性要求。

2.2.3 线性

取适量工作对照品置量瓶中，用四氢呋喃-异丙醇（5∶3）溶解并稀释至刻度，制成1.971 mg/ml的溶液作为线性储备液。精密量取线性储备液0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 ml，分别置于10 ml容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，制成线性浓度溶液，分别进样测定。得到线性方程y=0.085 7x–0.092 5 （r=1， n=5）。

2.2.4 重复性检测

1）日内 平行取6份样品（批号：20090717-1），它们的包封率分别是92.8%、92.5%、93.7%、90.6%、91.8%和91.9%；RSD为1.14%。

2）日间 对供试品（批号：20090717-1）进行包封率测定，连续3 d，每天平行检测3份（表3）。

日内与日间测定结果表明，该方法精密度良好。

2.3 多批样品测定

采用我们所建立的方法，对多批自制及不同厂家市售样品进行了检测（表4）。

上述结果表明，所建立的方法可有效检测样品的包封率并具有很好的区分力，为制剂的处方工艺研究提供了良好的基础。同时，数据也表明自制丙泊酚中/长链脂肪乳注射液包封率与市售品竟安基本相同，符合要求，且丙泊酚中/长链脂肪乳的包封率高于丙泊酚长链脂肪乳（力蒙欣）。

3 讨论

研究中我们发现，采用葡聚糖凝胶法及Sephadex G25 柱，虽经填料径高比、流动相种类与洗脱比例等条件的筛选，依然无法使游离与包封药物有效分离，检测结果不具区分力；在透析法中，经18 h药物浓度的检测，发现游离药物侧的药物浓度始终无法出现浓度平台；而在超速离心法中，检测结果的重现性很难把握。在这些研究的基础上，最终，我们通过超滤离心法，建立了具有良好区分度的包封率检测方法。我们推测多种方法未果的原因可能为微乳粒子的稳定性所致。通常，在结构上，微乳是较脂质体更不稳定的体系。游离与包封药物始终处在动态平衡中，缺少明确的区分界限。在超滤离心方法中，通过快速离心与超滤膜的物理分离，相比其他方法，较好地克服了溶剂或稀释剂对微乳稳定性的影响，同时通过超滤膜的快速物理阻隔，也避免了两部分药物进一步互吸、互溶的问题。

采用所建立的方法，我们通过对不同工藝样品、不同来源市售样品的考察，同时结合样品粒径、粒径分布、外观等指标的综合分析，证实了本方法的可靠性，从而为制剂工艺的筛选与优化提供了重要的监控手段。本研究因无法获得完全包封的理想样品，很难确知超滤膜是否对包封样品存在吸附。超滤膜上下层游离药物残留检测试验证明，膜本身存在对游离药物的吸附，因此，无法通过传统的回收率试验对方法的可靠性进行验证。因此，我们通过设计游离药物在膜上层的残留检测、样品的重复性检测和对不同样品检测的区分力等对方法的准确度与可用性进行了验证。

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