蛋白质组学应用于糖尿病视网膜病变发病机制的研究进展

21世纪,糖尿病(diabetes Mellitus，DM)已经逐渐成为一种流行病，其患病率为2%～6%[1]。糖尿病视网膜病变(diabetic retinopathy ，DR)，是糖尿病的一种微血管并发症，病变晚期可导致失明。过去常认为，DR的发生及进展与糖尿病的病程长、血糖控制不佳及高血脂有关。事实上，DR的病理变化是涉及到微血管病变、神经退化、免疫、继发性炎症反应等多种因素相互作用的结果。目前，DR的治疗方法主要包括：视网膜光凝，球内注药(抗VEGF)，以及玻璃体切除术，适用于该疾病的晚期，且病人之间疗效差异较大。差异表达的生物标志物能客观预示疾病的发生，监控疾病的进展，评估治疗的疗效，有助于DR的预防及治疗。蛋白质组(proteome)概念在1994年由Wilkins与Williams[2]提出，是指在特定的时间和空间内，一个基因组、一种组织或一种生物、细胞所表达的包括所有亚型以及经过修饰的全部蛋白质。而蛋白质组学(proteomics)就是从整体水平上来认识蛋白质的存在及其活动方式(表达、修饰、功能、相互作用等)，从而更好的阐明生命科学本质的学科[3]。以玻璃体、房水，血液、泪液、唾液等为研究对象，运用蛋白质组学从分子水平研究DR的发病机制，能对其进行早期诊断，寻找新的治疗靶点，从而改善其预后。

一、蛋白质组学的研究概况

根据研究目的和手段的不同，蛋白质组学可以分为表达蛋白质组学、结构蛋白质组学和功能蛋白质组学。表达蛋白质组学用于细胞内蛋白样品表达的定量研究。其研究技术为经典的蛋白质组学技术即双向凝胶电泳和图像分析。在蛋白质组水平上研究蛋白质表达水平的变化等，是应用最为广泛的蛋白质组学的研究模式[4]。

1.蛋白质主要分离技术 ：二维凝胶电泳(two dimensional electrophoresis，2DE)及液相色谱法(liquidchromatographic，LC)是两种常见的分离技术。2DE是一种用途广泛，以凝胶为基础，通过蛋白质电荷及分子大小，定性及定量分析的技术[5]。LC是一种不以凝胶为基础的高效分离技术。是利用待分离的物质在分离相与固定相的分配系数、吸附能力等亲和能力的不同来进行分离的[6]。

2.基于质谱的定量研究技术：质谱法(mmass spectrometry，MS)是用电场和磁场将运动的离子按它们的质荷比分离后进行检测的方法，可获得化合物的分子量及化学结构[7]。近年来，蛋白质组学能够飞速发展的最大功臣非质谱莫属。根据生物大分子的特性，基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和电喷雾质谱(ESI-MS)主要应用于生物质谱。基于质谱的定量蛋白质组学技术分为同位素标记技术(ICAT，iTRAQ，TMT，双甲基化，SILAC)，及非同位素标记(Lable-free)蛋白质组学定量技术。SILAC法是在细胞培养时，采用含有轻、中、重同位素型必需氨基酸的培养基进行细胞培养，细胞经传代后其蛋白质被同位素稳定标记，再通过质谱对蛋白进行鉴定及相对定量。ICAT法是将来源不同处理的蛋白质分别用重型ICAT试剂和轻型ICAT 试剂标记，等量混合后经胰蛋白酶酶切，进行质谱分析。ICAT法不能用于标记不含半胱氨酸或半胱氨酸含量低的蛋白质，且ICAT分子量相对较大，与蛋白质连接后可能会造成分子的空间位组。随着科学技术的不断进步，iTRAQ技术在蛋白质组学研究中已成为热点，它几乎可以标记所有的蛋白质，一次可同时处理8个样本[8]，具有灵敏度高、分辨率高、重复性好等诸多优点,这使其在医学和生物制药领域受到高度关注和广泛应用[9]。非同位素标记蛋白质组学定量技术，不需要昂贵的同位素进行标记，所需样本总量少，且不受样品数量的限制，直接采用液质联用技术对蛋白质酶解肽段进行质谱分析，比较不同蛋白质样品二级质谱的肽段离子的数量，并根据肽段数量进行相对定量[10]。

二、蛋白质组学在DR发病机制中的应用

1.增生膜中的生物分子标志物：因为视网膜是DR的病变部位，所以选取的研究对象与视网膜关系越紧密，越能够揭示DR的发生与发展。2010年Takada等[11]用LC/MS 技术，以特发性黄斑前膜(idiopathic epiretinal membranes ，ERMs)患者为对照组取其前膜，PDR患者为实验组取其增生膜，发现226种蛋白表达于PDR组，154种蛋白表达于ERM组，其中102种蛋白特异性存在于PDR中，30种蛋白特异性存在于ERM中，经过数据分析及RT-PCR对其验证发现，骨膜素(periostin)在PDR组中的表达量明显上调，该蛋白在细胞粘附中发挥重要作用，可能参与PDR的发生。

2.玻璃体中的生物分子标志物：玻璃体含有可溶性蛋白质及一些生物大分子，较易通过玻璃体切除术获取，且其贴近视网膜，能一定程度上反应视网膜的病变。Angi[12]等用蛋白质组学的方法证实了DR组玻璃体的蛋白质含量比非DR组的高。Sirpa[13]等用LC/MS技术选取138位患者的玻璃体进行分析，鉴定出了2482种蛋白质，并对其中的1351种蛋白质进行定量分析。与NPDR组相比，PDR组中有230种蛋白质显著上调，其中氧化应激及活性氧物质(PRDX2, PRDX6, CATA， ROMO1)在PDR组中显著上调，参与补体级联反应的(C1Q, CFAB, CFAD,CFAH, CFA)等因子及A1AT, A2MG, ANT3等凝血因子也在PDR组中显著上调。此外，该研究还指出，PDR组经抗VEGF治疗后，有72种蛋白被显著下调，其中包括(CNTN2, FAT4, FLNC)等细胞粘附因子，(APOBR和APOH)载脂蛋白等。

3.房水中的生物分子标志物：房水经睫状体分泌，从后房途经瞳孔流进前房，实现眼内循环。Chiang[14]等通过以凝胶为基础的蛋白组学研究技术与MALDI-TOF-MS联用，鉴定出了DR组与对照组房水中差异性表达的11种蛋白质，这些蛋白与营养运输、组织重组、血管生成、抗氧化及神经保护等生命活动相关(见表1)。Grigsby[15]等指出，DM的发病与炎症反应有关，而其机制之一是神经胶质细胞(retinal glial cells，RGC)的活化。随后，Stela[16]等用蛋白质组学的方法证实，与对照组相比，DR患者房水中RGC相关的炎性因子表达上调(见表1)。

4.血浆中的生物分子标志物：增生膜、玻璃体、房水因为与DR的发病部位联系紧密，所以是最为合适的研究对象。但它们必须通过手术获得，适合揭示疾病的进展，不适用于疾病的诊断。由于血浆相对容易获取，能为DR的诊断提供重要信息。虽然，研究者已经发现许多生物分子标志物与DR相关，有研究表明，当糖化血红蛋白每减少1%，DR的发生率将下降40%，DR的进展将减少25%[17]。Song和Xu分别通过meta分析发现，C反应蛋白的水平在DR患者中有所上升，同型半胱氨酸在I型糖尿病中与DR的发生密切相关[18，19]。然而，它们都是非特异性的炎性标志物，故限制了其应用。目前，只有糖化血红蛋白应用于临床监测DR的发生及进展。Gopalakrishnan[20]等用2DE与MALDI-TOF-MS技术发现血浆中RBP1、NUD10、NGB、HBG2、CD160在DR组中表达上调，其与物质运输、信号转导、氧传递及免疫应答相关。Yeh[21]等用亲和去除系统提取出2型糖尿病患者血浆中14种高丰度蛋白，再用LC-ESI-MS技术对低丰度蛋白进行分析，发现L1CAM在DR患者血浆显著上调。

5.泪液中的生物分子标志物：泪液是一种由蛋白质、脂质、粘液素、水和盐组成的一种复杂混合物。与血浆相比，其较少受全身疾病影响，取材更方便，且具有非侵入性，所以近些年，成为了寻找生物标志物的重要对象。DR的发生是由于眼内血管内血液成分的变化，所引起的视网膜的病变。虽然泪液并不直接与视网膜接触，但血液成分的变化也可能影响泪腺的分泌，从而造成泪液成分的改变。有研究指出，DR患者泪液中的载脂蛋白A-1[22]、糖化终产物[23]、氨基多糖[24]等物质表达上调。Aass[25]等通过蛋白质组学技术在泪液中鉴定出了1526种蛋白质。 Nguyen-Khuong[26]等用LC-ESI-IT-MS和串联MS技术对DR组及对照组泪液蛋白中的糖基化修饰进行分析，发现两组中的聚糖结构大多保守，只有一些低丰度蛋白质发生N-糖基化修饰，在DM与DR的发病中也恰巧存在N-糖基化修饰。这能为寻找提示DR的诊断及进展的生物标志物提供依据。

6.唾液中的生物分子标志物：除了泪液以外，唾液也具有取材方便、非侵入性等特点。唾液由唾液腺、口腔黏膜、牙周组织及口腔微生物共同参与分泌，能为唾液腺疾病、口腔疾病甚至系统性疾病提供诊断依据。Castagnola[27]等发现唾液中存在某些生物标志物能反映患者健康及疾病的状态。Chee[28]等用iTRAQ技术及LC-MS技术对唾液进行蛋白质组学分析，鉴定出了315种蛋白质，发现其中119种在NPDR组及PDR组中发生了差异性表达，它们与多种生物途径有关，说明DR的发病是多种机制相互作用的结果(见表1)。

三、结语

2030年，DR患者及严重视力损害的DR患者数量将可能分别达到1亿9100万及5630万[29]。 然而以上所提到的这些生物标志物，并没有像糖化血红蛋白一样应用于临床。近年来，蛋白质组学研究发展迅速，广泛地应用于各个领域。运用蛋白质组学寻找DR组与对照组中的差异蛋白，能更好的阐述DR的发病机制，有助于DR的早期预警。大规模以及多中心研究将能更客观地为DR找到生物标志物，从而为改善DR的预后提供帮助。

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