苦荞糖基转移酶的鉴定与基因克隆

摘 要：糖基转移酶除了决定糖苷键的形成，还可参与激素调节和信号转导来影响植物的生命活动，如参与黄酮类化合物的代谢。本文通过生物信息学手段，分析鉴定出苦荞的糖基转移酶，并进行基因克隆，为进一步研究糖基转移酶在黄酮代谢中的作用打下理论基础。

关键词：苦荞；糖基转移酶；生物信息；克隆

中图分类号：S961.6 文献标识码：A DOI：10.11974/nyyjs.20161131020

引言

糖基转移酶存在于植物的高尔基体与内质网中，通过转移活性糖基决定糖苷键的形成[1]。同时，该酶可以参与植物的激素调节和信号的转导来影响植物的生命活动，还具有减少细胞内物质毒性，维持细胞内稳态和防御环境压力的作用[2]。

苦荞作为一类富含黄酮类物质的植物，不仅具有食用营养价值而且在保健方面也能起到很好的疗效[3-5]。黄酮类化合物的存在可以使植物体更好地适应环境的改变，有利于提高植物体的生存和抗逆性[6-8]。糖基转移酶可影响黄酮醇代谢底物的能力，在某些条件下转换生产花青素 [9]。

1 材料与方法

1.1 材料

苦荞幼苗。

1.2 试剂

氯仿、戊酮、异丙醇、无水乙醇试剂均为分析纯；液氮，TE缓冲液。

1.3 主要实验仪器

研钵、冷冻离心机、电子天平、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统。

1.4 生物信息在线分析网站及软件

NCBI在线数据库http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/；

PROSITE在线数据库http：//prosite.expasy.org/；

蛋白理化性质分析使用Protparam；

Swiss-model在线数据库http：//swissmodel.expasy.org/。

1.5 苦荞基因组的快速提取

取苦蕎幼苗5g，加液氮研碎，吸入50ml离心管；

加入25mL氯仿—戊酮—乙醇（80：4：16）溶液，颠倒混匀；

冷冻离心机4℃下5000r/min离心5min；

移取上清液至25ml离心管中，加入等体积异丙醇，摇动至出现絮状沉淀；

在1.5ml离心管中加入1mLTE缓冲液，用玻璃棒缠出DNA絮团溶于TE中。

1.6 苦荞苦荞糖基转移酶基因的克隆

以苦荞基因组为模板，利用PCR技术扩增苦荞糖基转移酶基因，所用引物为生工公司合成的5A'-ATCCATTCGTTTTA-3A'和5A'-CAGAAGTTATATTG-3A'。

2 结果与分析

2.1 苦荞糖基转移酶序列查找

通过NCBI网站，使用拟南芥中糖基转移酶序列进行BLAST分析，搜索苦荞中糖基转移酶序列，结果如下：

SVGFKAGVKDYRLTYYTPEYQTKDTDILAAFRVTPQPGVPPEEAGAAVAAESSTGTWTTVWTDGLTSLDRYKGRCYDIEPVAGEESQFIAFVAYPLDLFEEGSVTNLFTSIVGNVFGFKALRALRLEDLRIPPAYSKTFQGPPHGIQVERDKLNKYGRPLLGCTIKPKLGLSAKNYGRAVYECLRGGLDFTKDDENVNSQPF。

2.2 蛋白质的理化分析

为了更加准确了解糖基转移酶，利用生物信息分析软件Protparam对其进行理化分析，分析结果显示：蛋白等电点为5.56，分子量22306.1Da，负电荷残基25个，正电荷残基23个，不稳定系数31.96，平均疏水性-0.339。

2.3 蛋白的功能域及保守域分析

使用PROSITE数据库[10]对苦荞糖基转移酶氨基酸序列进行功能域和功能位点分析，找到了其所具备的蛋白功能结构域（图1），结果显示该序列含有特征结构域GTITASGDLVPLSYIAG，证明查找的蛋白序列存在糖基转移酶的功能基础。

2.4 苦荞糖基转移酶基因的克隆

分析验证了查找到的苦荞糖基转移酶具有保守的功能结构域，为了进一步研究其在黄酮代谢中的作用，设计引物通过PCR技术扩增出约为800bp的基因片段（如图2）。

3 结论

本文通过生物信息学方法鉴定出了苦荞糖基转移酶，其由202个氨基酸组成，大部分为疏水氨基酸，等电点PI为5.56，具有保守的功能结构域，是有生物活性的蛋白。苦荞糖基转移酶基因的克隆为进一步研究糖基转移酶在黄酮代谢中的作用打下理论基础。

参考文献

[1]周文，陈刚，王瑛华，李玲.植物糖基转移酶及其在代谢工程中的应用[J].生物技术，2009（12）：17-24.

[2]金尚卉.拟南芥生长素糖基转移酶基因UGT74D1的鉴定及功能研究[J].山东大学学报，2013，11（3）：9-14.

[3]郎桂常.苦荞麦的营养价值与其开发利用[J].中国粮油学报，1996，11（3）：9-14.

[4]孟铭伦，王化忠.苦荞复合食品对糖尿病的降糖作用[J].辽宁实用糖尿病杂志，2006，6（37）：22-24.

[5]高立荣.荞麦的药用价值与营养价值[N].绍兴晚报，2010（23）：2-3.

[6]谭玉荣，陶兵兵，关郁芳，明建，赵国华.苦荞类黄酮的研究现状及展望[M].食品工业科技，2012（18）：41-43.

[7]李欣.苦荞麦中黄酮类化合物分析方法的建立[D].中国农业科学院，2010.

[8]谢棒祥，张敏红.生物类黄酮的生理功能及其应用研究进展[J].动物营养学，2003，15（2）：11-15.

[9]徐宝才，丁霄霖.苦荞黄酮的测定方法[J].无锡轻工大学学报，2003，3（22）：99-100.

[10]邹蔚然，郭万株.蛋白激酶基因的克隆和生物信息学分析[D].四川农业大学，2008.

作者简介：赵丹（1986-），男，山西太原人，研究生学历，助教，研究方向：分子生物学。