胃蛋白酶检测在反流性疾病中的研究进展

杜 兴，胡志伟，汪忠镐，燕 超，吴继敏

胃蛋白酶检测在反流性疾病中的研究进展

杜 兴，胡志伟，汪忠镐，燕 超，吴继敏

反流性疾病包括胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease， GERD)与咽喉反流(laryngopharyngeal reflux， LPR)，其中GERD是最常见的消化道疾病，而LPR是引起嗓音异常的主要原因之一，严重影响患者的生活质量，造成巨大的医疗负担。而国内很多医师对反流性疾病认识不足，导致很多患者被误诊误治。随着对反流性疾病研究的深入，人们逐渐认识到胃蛋白酶在本病的发生发展过程中有重要意义，尤其对于LPR，其可能是导致相关变病的主要原因。食管外组织或器官胃蛋白酶的检出为反流性疾病与肺部、耳鼻咽喉等疾病的相关性提供了直接证据，为深入探究反流性疾病的病理生理学机制提供了新的研究方向或线索。同时大量研究表明体液胃蛋白酶检测对诊断反流性疾病具有良好的应用前景，有望取代具有创伤性的诊断手段。

反流性疾病；胃食管反流；咽喉反流；胃蛋白酶

反流性疾病主要包括胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease， GERD)与咽喉反流(laryngopharyngeal reflux， LPR)，是指胃内容物反流至食管、咽喉部，甚至气道、肺、口腔、鼻腔、中耳等部位，造成局部组织的破坏，引起一系列症状和体征的总称[1]。既往认为胃内容物中的胃酸(hydrochloric acid， HCL)是引起反流性疾病相关症状与体征的主要因素。现在越来越多的证据表明，胃内容物中的胃蛋白酶在反流性疾病的发生发展过程中起重要作用。现复习相关文献，对胃蛋白酶检测在反流性疾病中的应用与进展进行综述。

1 胃蛋白酶的理化特性与生理作用

胃蛋白酶原(pepsinogen， PG)是胃蛋白酶的无活性前体，主要是由泌酸腺的胃壁主细胞合成和分泌。应用电泳技术及根据免疫源性可将PG分为两大同工酶原，即胃蛋白酶原I(PGI，由胃底腺的主细胞和黏液颈细胞分泌)与胃蛋白酶原Ⅱ(PGⅡ，主要来源于全胃腺)，十二指肠上段的Brunner腺、前列腺和胰腺也能产生少量的PGⅡ，PGⅡ占胃黏膜合成PG总量的25%。PG大部分进入胃腔转化为有活性的胃蛋白酶，仅有1%通过胃黏膜毛细血管进入血液循环并经肾脏排出。

在酸性环境或自我激活作用下，PG分离出1个含有44位氨基酸的多肽后形成有活性的胃蛋白酶[2]。胃蛋白酶不是单一的分子，而是由一些结构类似的同工酶家族组成。Bardhan指出应用高效阴离子交换色谱法可将胃蛋白酶分为1、2、3、5亚型，胃蛋白酶3又可进一步分为胃蛋白酶3A、3B、3C，其中胃蛋白酶3B分子量最大、所占比重最高(70%)[3]。胃蛋白酶只有在酸性环境中才能发挥作用。Yufera等[4]发现人胃蛋白酶在pH 2.0环境中活性最高，在pH 6.5时呈失活状态，但能保持完整的稳定状态，当pH再次下降时其活性可恢复。

2 质子泵抑制剂(proton pump inhibitors， PPIs)对胃蛋白酶的影响

关于PPIs对HCL分泌影响的研究报道较多见，但有关PPIs对胃蛋白酶影响的报道则较少见。一项研究将大剂量奥美拉唑(60 mg每日1次)应用于8例健康志愿者，连续使用9 d后检测发现虽总体HCL分泌量明显减少，但因胃液分泌量显著减少，胃蛋白酶的浓度却显著升高[5]。高剂量的PPIs或新一代PPIs抑酸效果更强，可使胃蛋白酶处于失活状态的时间更长，但仍不能使胃液达到令胃蛋白酶变性的pH水平[6]。总之，PPIs对胃蛋白酶的分泌影响不显著，同时可导致胃蛋白酶浓度的升高，富含高浓度胃蛋白酶的反流液对食管外组织或器官更具损伤性。这些研究发现为以后研究胃蛋白酶在反流性疾病中的应用价值提供了理论基础。

3 胃蛋白酶检测在GERD中的应用

研究报道胃蛋白酶可存在于反流性疾病患者的食管、咽喉、气道、口腔、鼻腔、鼻窦、咽鼓管及中耳等部位。胃蛋白酶检测技术主要有蛋白印迹、免疫测定技术。Peptest检验是已经商业化的体液或分泌液(如唾液、痰液)胃蛋白酶检测技术，由免疫测定技术改良而成，利用两种单克隆抗体进行体外检测，方法简便，几分钟内即可得出结果[7-8]。

目前诊断GERD与LPR的“金标准”分别为食管24 h多通道腔内阻抗联合pH监测(multichannel intraluminal impedance， MⅡ-pH)和24 h双探针pH监测，但二者诊断敏感性低，且具有创伤性，很多患者难以耐受。国内学者刘鹏等[9]采用蛋白印迹技术检测80例疑似GERD患者的唾液胃蛋白酶，样本采集时间分别为睡前、症状发作时及晨起时，结果发现53.8%的患者胃蛋白酶阳性，健康对照组均为阴性；以24 h pH监测为“金标准”，唾液胃蛋白酶诊断GERD的敏感性和阴性预测值较为理想(89%和95%)，特异性和阳性预测值欠佳(68%和44%)；同时发现症状发作时胃蛋白酶阳性率最高。毛华等[10]采用乳胶增强免疫比浊法检测GERD、慢性胃炎患者及健康对照者晨起空腹时唾液PGI、PGⅡ浓度，结果显示GERD组PGI浓度高于慢性胃炎组及健康对照组，GerdQ表评分与PGI浓度存在正相关(r=0.466，P=0.014)；受试者工作特征(ROC)曲线分析显示，PGI临界值取2.5 μg/L时，胃蛋白酶诊断GERD的敏感性为70.4%、特异性为71.4%。类似的是，外国学者Saritas等[11]通过检测58例疑似GERD患者与51例健康对照者唾液胃蛋白酶，发现两组胃蛋白酶阳性率差异无统计学意义(22% vs 12%，P=0.25)，但分层分析发现经胃镜确诊的反流性食管炎患者、经食管48 h pH监测诊断的GERD患者及仅有GERD症状患者的胃蛋白酶阳性率均高于健康对照组；以胃镜或48 h pH监测为诊断标准，胃蛋白酶检测诊断GERD的阳性预测值、阴性预测值分别为81%、78%，故作者认为胃蛋白酶检测对GERD具有良好的诊断价值。之后有研究进一步证实，唾液胃蛋白酶检测可作为诊断GERD的一种无创、简易、方便的新手段，有望取代目前具有创伤性的胃镜或pH监测诊断方法[12-13]。

Starosta等[14]对96例慢性肺疾病患儿进行肺泡灌洗液胃蛋白酶检测与食管24 h pH监测，结果发现68%的患儿食管近端酸反流指数升高；与食管近端酸反流阴性者相比，阳性者肺泡灌洗液胃蛋白酶浓度更高；同时发现肺泡灌洗液中中性粒细胞、蛋白羰基和白细胞介素-8(IL-8)水平与食管近端反流事件相关。据此作者提出GERD是儿童慢性肺疾病的重要影响因素，肺泡灌洗液胃蛋白酶检测可作为一种重要的诊断方法。此后有更多研究通过呼吸道分泌物或肺泡灌洗液胃蛋白酶检测证实，GERD与支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease， COPD)、慢性咳嗽等肺部疾病的相关性[13-15]。Timms等[16]研究显示，采用酶联免疫吸附(ELISA)检测技术发现同时患有GERD的COPD患者呼出气体冷凝液胃蛋白酶浓度高于不伴有GERD的患者及健康者，指出呼出气体冷凝液胃蛋白酶检测可用于筛选伴有GERD的COPD患者[17-18]。

4 胃蛋白酶检测在LPR中的应用

LPR也称食管外反流，是指胃十二指肠内容物反流至食管以上高度，到达咽、喉、口腔及气道等部位，引起一系列症状及并发症，与众多耳鼻咽喉疾病及呼吸道疾病相关[19-21]。目前临床上用于诊断LPR的手段主要有反流症状指数(RSI)量表、反流检查计分(RFS)量表和PPIs试验性治疗及LPR监测，但效果均不理想。

Knight等[22]采用免疫分析法检测疑似LPR患者喉部痰液胃蛋白酶，并与24 h双探针pH监测相比较，发现胃蛋白酶阳性患者食管与咽喉部检测液pH显著低于阴性者，指出胃蛋白酶检测显示出理想的诊断价值，诊断敏感性、特异性分别高达100%、89%。李湘平等[23]以RSI量表、RFS量表和PPIs试验性治疗联合诊断结果为诊断标准，发现LPR组深咳咽喉部唾液胃蛋白酶浓度高于慢性咽喉炎组和健康对照组，胃蛋白酶诊断LPR的敏感性、特异性、漏诊率及误诊率分别为93.8%、46.2%、6.2%、53.8%。同时，中国学者Jiang等[24]发现LPR患者勺状软骨间黏膜胃蛋白酶阳性率高于对照组(80.0% vs 14.3%，P<0.01)，诊断LPR的敏感性、特异性分别为100.0%、47.6%，表明喉黏膜胃蛋白酶检测是诊断LPR的敏感方法。另有研究发现，LPR患者唾液胃蛋白酶、胆汁酸浓度显著高于健康对照组(P=0.005，P=0.023)，相关性分析发现LPR患者RSI、RFS与唾液胃蛋白酶、胆汁酸浓度相关，据此作者认为唾液胃蛋白酶结合胆汁酸检测可用于LPR的诊断，尤其是胆汁性LPR[25-26]。近两年研究进一步证实，唾液/痰液胃蛋白酶检测可作为一种廉价、无创、易于患者接受的LPR诊断方法[27-28]。

Blumin和Johnston[29]通过LPR患儿气道分泌物与喉部黏膜胃蛋白酶检测分析发现，LPR是特发性声门下狭窄的重要发病机制。Krishnan等[30]对118例有呼吸道症状和(或)耳鼻喉症状的患儿进行喉-支气管镜检查与气道抽吸物胃蛋白酶检测，结果显示喉-支气管镜下有阳性发现(如喉部水肿、红肿、喉室闭塞及气道分泌物增多)与气道胃蛋白酶表达呈正相关，并且胃蛋白酶表达与患儿哮喘、肺囊性纤维化病史显著相关。Gill等[31]发现LPR患者喉黏膜上皮细胞胞内存在胃蛋白酶，而健康对照组不存在；LPR患者喉黏膜E-钙黏蛋白、碳酸酐酶Ⅲ(CAⅢ)表达降低或缺失。据此，作者认为LPR与胃蛋白酶、E-钙黏蛋白及CAⅢ的表达下调相关，E-钙黏蛋白、CAⅢ表达降低导致喉黏膜防御功能降低，而胃蛋白酶可消化分解喉组织细胞引起损伤。此外，Wang等[32]将声带息肉患者的声带组织进行免疫组织化学染色，发现胃蛋白酶在声带息肉组织中的表达较健康对照组明显升高，提示反流物胃蛋白酶阳性是声带息肉发生的危险因素，同时指出声带息肉胃蛋白酶检测对LPR的诊断价值较RFS、RSI及反流监测高。近期来自Luebke等[33]的研究发现，反流物胃蛋白酶与患儿软喉症相关，但具体发生机制尚需进一步研究。谭嘉杰等[34]通过研究声带白斑及喉癌组织中胃蛋白酶表达，发现LPR可能参与喉癌的发生，但胃蛋白酶参与喉黏膜上皮恶变的机制还有待进一步研究。

5 胃蛋白酶与慢性鼻-鼻窦炎及分泌性中耳炎的相关性

近几年国内外学者通过胃蛋白酶检测对反流性疾病与慢性鼻-鼻窦炎及分泌性中耳炎的相关性进行了研究。Ozmen等[35]以咽喉pH监测为诊断标准，结果发现，与对照组相比慢性鼻窦炎患者存在更高的LPR发生率(88% vs 55%，P<0.05)，提示LPR可能是慢性鼻窦炎发生的重要机制，这与Iannella等[36]的结论相一致。金日群团队[37]采用ELISA技术检测50例慢性鼻窦炎患者鼻腔分泌物胃蛋白酶，根据RSI量表、RFS量表及PPIs试验性治疗三联诊断将患者分为LPR组和非LPR组，结果发现LPR组胃蛋白酶阳性率高于非LPR组及健康对照组，显示胃蛋白酶检测诊断LPR的敏感性高于三联诊断法。之后该团队及胡全福等[38-39]报道鼻腔分泌物胃蛋白酶检测与咽喉24 h pH监测及三联诊断法均具有较好的一致性，是一种无创的、可行的LPR诊断方法。O'Reilly等[40]对509例分泌性中耳炎患儿进行研究，发现20%的患儿中耳渗出液中可检出胃蛋白酶，其水平显著高于对照组(20.0% vs 1.4%，P<0.05)。2015年该团队又报道分泌性中耳炎患儿中耳渗出液胃蛋白酶与IL-8相关，指出LPR与中耳炎性病变密切相关，但具体机制需要进一步研究[41]。另外，多位学者证实分泌性中耳炎患儿中耳渗出液胃蛋白酶是反流所致，并非局部血液渗出所致，并可作为诊断分泌性中耳炎患者是否存在LPR的可靠指标[42-44],这一结论得到Formanek等[45]的进一步证实。

6 其他研究进展

6.1胃蛋白酶与反流性疾病的转化研究 正常人每日可发生数十次胃食管反流而不出现食管症状，而咽喉部每周出现3次反流即可造成咽喉黏膜的损害并引起咽喉部症状，提示LPR的发生机制与GERD不同。美国学者Johnston及其同事针对胃蛋白酶与LPR的相关性进行了大量的研究报道。首先Johnston等[46]通过蛋白印迹法分析LPR患者喉黏膜上皮胃蛋白酶表达与应激蛋白(Sep70、Sep53、Hsp70)的相关性，发现与健康对照组相比，LPR组喉黏膜Sep70表达减少(P=0.027)，Sep53表达有减少趋势(P=0.056)，且喉黏膜上皮胃蛋白酶存在量与Sep70呈负相关。猪喉组织培养发现单纯HCL可导致Sep70和Sep53升高，加入胃蛋白酶后Sep70、Sep53减少或消失。利用动物体外模型，Johnston等[47]发现激活状态的胃蛋白酶可致猪喉部组织CAⅢ、Sep70表达下调，而失活状态的胃蛋白酶、HCL则不能。继之Johnston等[48]利用人体外组织培养及毒性分析等技术发现失活状态的胃蛋白酶具有细胞毒性作用，可致线粒体、高尔基体等细胞器损伤，并可改变多种应激基因及毒性基因的表达。在上述研究发现的基础上，Johnston等[49-50]发现并证实滞留在咽喉部的胃蛋白酶可通过受体介导的胞吞作用被摄入细胞内。因此，Johnston等[51]指出胃蛋白酶可被再次发生的酸性反流所激活，或者被胞吞的胃蛋白酶在酸性介质(高尔基体pH 5.5)中恢复活性，通过改变应激蛋白的表达引起应激反应等途径造成细胞破坏，在LPR的发生发展过程中起重要作用。

Bulmer等[52]报道不同部位的喉黏膜对胃蛋白酶、HCL有不同程度的耐受性，其中声门下黏膜最为敏感，且胃蛋白酶与HCL对喉黏膜的损害具有协同作用。Bathoorn等[53]将人支气管上皮细胞暴露于胃蛋白酶、HCL溶液中，通过分析细胞增殖和细胞因子表达发现胃蛋白酶对细胞的毒性和炎性作用呈浓度依赖性和pH依赖性，即胃蛋白酶浓度越高、pH越低，有害作用越显著。

Adhami等[54]利用犬动物模型探究胃反流物(胃蛋白酶、HCL)与十二指肠反流物(胆汁酸、胰蛋白酶)对喉黏膜的有害作用，结果显示酸性反流中胃蛋白酶是造成喉部组织损伤的主要因素，十二指肠反流物并无显著的有害作用。另外，Ali等[55]报道胆汁酸(包括结合胆汁酸与未结合胆汁酸)对胃蛋白酶活性无影响。而Develoglu等[56]报道称胃蛋白酶、胆汁酸均可致中耳黏膜发生炎性反应和上皮化生改变，尤其胆汁酸的作用最为明显。

6.2胃蛋白酶检测在胃食管反流误吸诊断中的应用 气道分泌物或肺泡灌洗液中胃蛋白酶的检出为GERD相关性肺疾病的诊断提供直接证据。Savarino等[57]研究发现，特发性肺纤维化患者肺泡灌洗液胃蛋白酶、胆汁酸浓度均高于间质性肺疾病患者和健康对照组，同时24 h MⅡ-pH监测发现特发性肺纤维化患者异常酸暴露比例也高于间质性肺疾病患者和健康对照组，提示特发性肺纤维化与胃食管反流误吸密切相关。近几年有研究发现，与葡萄糖检测方法相比，胃蛋白酶检测对诊断胃食管反流误吸具有更高的敏感性[58-61]。

7 小结

HCL、胃蛋白酶及胆汁酸的协同作用是造成食管病变与GERD症状(如反酸、胃灼热)的主要因素，其中HCL是关键因素；而LPR的主要致病因素是胃蛋白酶[62]。大量研究显示胃蛋白酶检测对GERD、LPR等反流性疾病具有较好的诊断价值，但不同研究之间取样时机、检测方法及“金标准”的选择不尽相同，研究结果参差不齐，尚需进一步规范化；在治疗方面的应用价值尚无研究报道。另外，食管外器官或组织胃蛋白酶的检出为反流性疾病与肺部疾病、耳鼻喉科疾病的相关性提供了直接证据或线索。加强对胃蛋白酶在反流性疾病中作用的认识，有利于加深临床医师对反流性疾病发生机制的理解及新靶向药物的研发。

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首都临床特色应用研究资助项目(Z141107002514109)

100053 北京，火箭军总医院胃食管反流病科

吴继敏，E-mail:zhonggaowang@126.com

R573.9

A

1002-3429(2017)10-0107-06

10.3969/j.issn.1002-3429.2017.10.035

2017-02-23 修回时间：2017-05-10)