免疫组库及高通量分析技术在原发性胆汁性胆管炎中的研究进展

赵丹彤， 郭昌龙， 闫惠平

(1 首都医科大学附属北京佑安医院 自身免疫性肝病临床研究中心暨临床检验中心， 北京 100069；2 国家卫生计生委科学技术研究所， 北京 100081)

免疫组库及高通量分析技术在原发性胆汁性胆管炎中的研究进展

赵丹彤1， 郭昌龙2， 闫惠平1

(1 首都医科大学附属北京佑安医院 自身免疫性肝病临床研究中心暨临床检验中心， 北京 100069；2 国家卫生计生委科学技术研究所， 北京 100081)

原发性胆汁性胆管炎(PBC)是一种器官特异性自身免疫性肝脏疾病，发病机制尚不明确。T淋巴细胞受体(TCR)和B淋巴细胞受体(BCR)互补决定区3氨基酸组成和排列顺序呈现高度多样性，构成容量巨大的抗原识别受体库，即免疫组库。采用第二代测序技术结合多重PCR或扩增子救援多重PCR技术研究PBC患者免疫组库特征是近年的研究热点，目前发现PBC存在特异性CD4+T淋巴细胞大量克隆扩增，B淋巴细胞克隆多样性、体细胞高频突变及类别转换现象明显减少，熊去氧胆酸治疗后克隆多样性增加。上述发现有待通过大范围体内和体外试验及不同的免疫组库研究策略进行验证。

肝硬化， 胆汁性； 免疫组库； 互补决定区； 综述

原发性胆汁性胆管炎(primary biliary cholangitis，PBC)，又名原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis，PBC)，是一种以胆汁淤积为特点的慢性自身免疫性肝病，发病机制尚不完全清楚，可能与遗传背景、感染及环境等因素所致的异常自身免疫有关[1]。PBC患者存在细胞免疫和体液免疫的异常，以血清抗线粒体抗体(AMA)阳性及自身免疫介导的肝内中小胆管损伤为特点[2]。

免疫组库(immune repertoire，IR)指在任何指定时间，某个个体的循环系统中所有功能多样性T淋巴细胞和B淋巴细胞的总和，反映机体整体免疫能力。T淋巴细胞受体(T cell receptor, TCR)和B淋巴细胞受体(B cell receptor, BCR)互补决定区(complementarity determining regions,CDR)3区氨基酸组成和排列顺序呈现高度多样性，构成容量巨大的抗原识别受体库，即免疫组库。在个体水平，每个机体的免疫组库是有差别的，它取决于主要组织相容性复合体(MHC)位点的遗传多态性、抗原接触史及免疫系统的调节与修复能力。近年，随着基因扩增和高通量测序技术的发展，免疫组库高通量测序及临床应用成为生物信息学和医学研究的热点，本文就该技术在PBC中的研究进展做一综述。

1 TCR免疫组库与PBC

T淋巴细胞通过TCR识别并清除外环境中的病原体及其产生的毒素、内环境中因基因突变产生的肿瘤细胞、自身凋亡组织细胞或自身变性抗原，保持机体内环境稳定。TCR由α/β或γ/δ异源二聚体组成，参与特异性免疫应答的T淋巴细胞主要是α/β T淋巴细胞，占外周T淋巴细胞的90%～95%。TCR β链CDR3在抗原特异性识别中起关键作用，是直接与抗原肽的结合位点，其编码基因位于人类7号染色体(7q34)，全长620 kb，由50多个可变区(V区)基因片段、2组上游D基因片段/下游恒定区(C区)基因片段、6～7个J区基因片段组成，这些基因在T淋巴细胞发育早期不连续分布，在胸腺内原始T细胞阶段，D-J区片段连接为DJ片段；在成熟T淋巴细胞阶段，V、DJ、C区基因片段相连成VDJC片段。

据推测，胚系VDJC基因片段随机组合、重排以及TCR α/β链和γ/δ链V区基因重排产生的TCR克隆数量高达1015～1018，构成多样性极其丰富的T淋巴细胞抗原受体库，即TCR免疫组库，是机体所有功能性T淋巴细胞总和。不同T淋巴细胞克隆有不同序列或长度的TCR-CDR3基因，翻译出不同的CDR3多肽序列，从而反映T淋巴细胞功能状态。在发生特异性免疫应答时，TCR多样性发生变化，出现寡克隆甚至单克隆扩增，随着胸腺再生，大量原始T淋巴细胞增殖，TCR免疫组库多样性得以恢复和重建。

自身抗原特异性T淋巴细胞克隆扩增在自身免疫疾病的发生、发展中起重要作用。PBC主要靶抗原是位于线粒体内膜上参与能量代谢的丙酮酸脱氢酶复合体，免疫荧光检测显示AMA靶抗原均匀分布于患者肝脏胆管上皮细胞，且PBC患者胆管上皮细胞和肝细胞表达大量的MHCⅠ、Ⅱ类分子以及免疫识别所需的淋巴细胞共刺激分子和细胞间黏附分子，提示抗原特异性T淋巴细胞介导的免疫反应导致胆管上皮细胞损伤。

在特异性抗原的刺激下，TCR谱出现的选择性分布异常预示着相应T淋巴细胞的克隆扩增性增殖及功能性改变。鲍俊杰等[3]利用扩增子救援多重PCR(amplicon rescued multiplex PCR,arm-PCR)技术和高通量测序技术，半定量扩增并测序了7例PBC患者CD4+TCR Vβ链的CDR3序列，初步建立了PBC患者外周血CD4+T淋巴细胞TCR Vβ链CDR3免疫组库，通过与健康对照组比较，初步筛选出4种优势取用氨基酸序列，提示特征性(具有特定性TCR Vβ CDR3序列)的CD4+T淋巴细胞大量克隆扩增可能是PBC发生发展的重要因素。但该研究例数较少，有待通过大范围的体内和体外试验进一步验证。

2 BCR免疫组库与PBC

BCR具有抗原结合特异性，在同一个体内，其多样性高达109～1012，构成容量巨大的BCR库，赋予个体识别各种抗原，产生特异性体液免疫应答的巨大潜能。BCR即膜表面免疫球蛋白，是B淋巴细胞特异性识别和结合抗原决定簇的结构，主要由两条重链和两条轻链连接而成，其中重链(H链)分为V区、C区、跨膜区及胞质区；而轻链(L链)则只有V区和C区。V区由VH和VL两个结构域组成，各有3个CDR即CDRl、CDR2和CDR3。决定B淋巴细胞识别抗原的关键部位是最具多样性的重链CDR3区，其多样性的产生源于IGHV(51个功能性基因片段)末端-IGHD(23个功能性基因片段)-IGHJ前端(6个功能性基因片段)基因重排及V-D和D-J连接时非模板依赖性核苷酸插入或剪切和体细胞高频突变等。

为了解PBC患者潜在的自身抗体特点及整体免疫功能状态，Foreman等[4]采用免疫扫描分析技术比较了35例PBC患者和18例健康对照者IgM、IgG和IgA BCR VH家族基因取用率，除部分患者存在VH3a和VH4家族BCR寡克隆扩增外，并未发现个体内和个体间IgG、IgA和IgM CDR3区常见的克隆扩增有明显不同。

Tan等[5]采用多重PCR结合高通量测序技术对43例PBC患者Ig基因进行研究，通过与健康对照者比较，发现PBC患者存在14个B淋巴细胞克隆扩增、8个B淋巴细胞克隆消失的情况，与IgM相对升高现象一致；同时PBC患者特别在肝硬化阶段，B淋巴细胞克隆多样性、体细胞高频突变及类别转换现象明显减少，熊去氧胆酸治疗后克隆多样性增加，IgM受体克隆扩增减少，但体细胞高频突变现象没有明显变化。

3 免疫组库测序技术

20世纪90年代初，Pannetier等[6]首次采用免疫扫描分析技术将CDR3多样性和长度分布引入TCR受体库研究，在此基础上研发了免疫扫描谱系分析技术，该技术不仅能发现单/寡克隆增生的T淋巴细胞，还能提供T淋巴细胞应答库的组成信息，为疾病个体化诊疗提供了新的思路和方法，特别在自身免疫疾病TCR免疫组库研究中有广泛应用[7-9]，但该技术仅能粗略分析CDR3多样性或部分序列组成，若研究其与疾病或疾病活动度的关系、患病个体间及患病群体与健康群体间免疫组库的差异，需进一步在基因水平对其进行深入研究。

以454测序系统、SOLiD系统和HiSeq基因组分析平台为代表的第二代高通量测序技术，又称“下一代”测序技术("Next-generation" sequencing technology，NGS)，为描绘免疫组库的全貌提供了强有力的技术支撑[7-8]。NGS在实现低成本、高通量DNA测序的同时，因其显著的测序深度，使判读单个碱基的准确性大为改观。个体的适应性免疫系统可以产生多达1012BCR和1012TCR，传统的第一代测序技术根本无法快速地完成大规模的序列读取和分析，NGS可从克隆型频率、CDR3多样性、CDR3序列分析、V等位基因确认等角度对TCR/BCR免疫组库进行深度测序和分析，因此，NGS在TCR/BCR研究中已经开始发挥重要作用[9-10]。

在基因扩增技术方面，NGS与多重PCR技术，特别是以arm-PCR的有效结合，使模板的扩增效率大大提高，具有较高的灵敏度和特异度，真正意义上使免疫组库的建立变为现实。美国HudsonAlpha生物技术研究院研究员韩健博士研发的基于arm-PCR 技术的iCubate技术平台可以使加样后核酸提取、扩增、检测操作在密闭空间内自动进行，提高同一反应管内多个目标基因的扩增效率，减少操作污染，具有多重扩增、全自动、全封闭的特点。该研究团队成员王春林博士等[11]采用该技术从1例健康人外周血8个T淋巴细胞亚群中扩增出了与cDNA模板序列对应的约167万个有效序列，其中，CDR3序列共有约148万个。鉴定了T淋巴细胞亚群10个最常见的TCRα和TCRβ序列，例如TCRα-CDR3区“APEAMGGSEKLV”多肽序列。

此外，Gao等[12]并未采用传统的454测序系统或Illumina基因组分析平台，而采用新开发的Ion Torrent个人基因组测序仪从脑膜瘤患者外周血中扩增出IgH V(D)J重组基因后进行测序，整个过程在1 d内完成，可以高效、低成本、便捷的监测V(D)J基因重组情况，为免疫组库研究提供了参考，具有较广泛的应用前景。

4 免疫组库生物信息学分析

在免疫组库数据分析方面，韩健博士成立的iRepretoire公司以免疫组库方面的产品和服务为主，研究者注册并登陆该公司网站后，将测序的原始数据上传，利用iRmap软件在除去数据中的冗余序列、短片段序列及测序质量差的序列后，将数据与公共数据库IMGT(http://www.imgt.org)进行比对查询，根据IGH-CDR3区V、J、D各区段的特点鉴定出每个样本的CDR3多肽序列，最后通过2D热力图、CDR3列表、D50、树形图、V取用分布、CDR3长度分布、N端添加的碱基数分布等参数和图表来描述样本的免疫学特征。国家人口计生委科学技术研究所与韩健博士、王春林博士合作，已建立起完整的免疫组库研究技术平台，开展了包括中国正常新生儿的免疫组库、正常妊娠及妊娠高血压孕妇的免疫组库、寻常型银屑病的免疫组库在内的多项研究[13-16]，目前正与北京佑安医院合作开展PBC患者BCR免疫组库研究，从而了解中国各类疾病的免疫组库的变化信息，为用免疫组库技术筛选各型疾病的诊断及治疗标志物以及临床治疗提供指导参考。

此外，Michaeli等[17]在没有模板基因的情况下，整合不同软件自主研发出具有高度模块化的数据分析系统，能自动分析NGS测序后Ig基因，有助于BCR免疫组库多样性的分析。

5 挑战与展望

免疫组库多样性对健康起着至关重要的作用，多样性程度越高越能有效抵抗病原体，亚型越少疾病易感性越高。目前研究显示，健康个体免疫组库多样性程度高，无明显偏移；亚健康或疾病状态个体免疫组库多样性程度降低，甚至只有个别亚克隆存在。然而，免疫组库多样性受个体对特殊病原体抗原的暴露影响，研究中应仔细评估患者的健康状况。

在技术方面，免疫组库测序研究的最大问题是扩增过程引入的偏差，arm-PCR克服了传统多重PCR的缺限，整个反应体系在指数增长期使用共同引物进行扩增，所有目标序列的扩增效率基本一致，使得同一反应体系内多个目标基因可以同时高效扩增，因此，将arm-PCR应用于免疫组库的研究能够如实地反映每个克隆的比例，确保不会造成偏移，可将每段CDR3序列都扩增出来。基于arm-PCR技术的大样本高通量测序研究PBC患者的免疫组库特征，将进一步揭示PBC的免疫应答机制，为寻找生物标志物、疗效监测和免疫治疗提供科学依据。

高通量测序技术和方法的成熟与进步为研究PBC患者免疫组库特征提供了新的机遇。但应认识到，目前高通量测序成本仍相对较高、产生的数据量巨大，数据的解读和分析过程复杂，现有的临床研究受样本例数限制存在一定的局限性等问题，免疫组库应用于临床尚需软硬件和大数据研究的探索与积累。

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引证本文：ZHAO DT, GUO CL, YAN HP. Research advances in immune repertoire and high-throughput sequencing in primary biliary cholangitis[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(7): 1387-1390. (in Chinese) 赵丹彤， 郭昌龙， 闫惠平. 免疫组库及高通量分析技术在原发性胆汁性胆管炎中的研究进展[J]. 临床肝胆病杂志, 2017, 33(7): 1387-1390.

(本文编辑：王 莹)

Research advances in immune repertoire and high-throughput sequencing in primary biliary cholangitis

ZHAODantong,GUOChanglong,YANHuiping.

(ClinicalResearchCenterforAutoimmuneLiverDisease&ClinicalLaboratoryCenter,BeijingYouAnHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100069,China)

Primary biliary cholangitis (PBC) is an autoimmune liver disease with unclear pathogenesis. The amino acid composition and sequence in the complementarity-determining region 3 of T cell receptor (TCR) and B cell receptor (BCR) are highly diverse, which forms a large antigen recognition receptor repertoire, i.e., immune repertoire. In recent years, second-generation sequencing techniques combined with multiplex PCR or amplicon rescue multiplex PCR have been used to study the features of immune repertoire in PBC patients, and it has been found that PBC patients have clonal expansion of specific CD4+T lymphocytes, clonal diversity of B lymphocytes, somatic hypermutation, and reduction in class switch, as well as increase in clonal diversity after treatment with ursodeoxycholic acid. These findings need to be confirmed by large-scale in vivo and in vitro studies and different immune repertoire research strategies.

liver cirrhosis, biliary; immunerepertoire; complementarity determining regions; review

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.07.041

2017-01-09；

2017-01-26。

国家自然科学基金青年科学基金资助项目(81400609)；北京市医院管理局临床医学发展专项——“扬帆”计划资助项目(ZYLX201711)

赵丹彤(1980-)，女，副研究员，博士，主要从事肝病相关实验诊断学研究。

R575.22； R446.62

A

1001-5256(2017)07-1387-04