let-7在肝细胞癌诊疗中的机制及意义

霍婷婷， 王东旭， 张明智， 赵 磊，

(1 郑州大学第一附属医院 肿瘤科， 郑州 450052； 2 山东大学附属山东省肿瘤医院 肝胆外科， 济南 250117；3 济南大学，山东省医学科学院医学与科学学院， 济南 250200)

let-7在肝细胞癌诊疗中的机制及意义

霍婷婷1， 王东旭2，3， 张明智1， 赵 磊1，2，3

(1 郑州大学第一附属医院 肿瘤科， 郑州 450052； 2 山东大学附属山东省肿瘤医院 肝胆外科， 济南 250117；3 济南大学，山东省医学科学院医学与科学学院， 济南 250200)

microRNA(miRNA)在转录后水平发挥重要的基因调控作用。近年来，随着miRNA在肿瘤发生、发展中的研究成为热点，恶性肿瘤的基因靶向治疗也取得了初步成就。miRNA let-7是最早发现的miRNA之一，可调控细胞周期、血管生成等，尤其是参与调节多种肿瘤细胞的增殖、分化和凋亡；let-7家族多数成员有抑癌基因的作用，在多种肿瘤组织中呈低表达而在恶性肿瘤患者血清中呈高表达；let-7与肝细胞癌(HCC)的侵袭性和耐药性密切相关，表明let-7有望成为肝癌早期诊断标志物，并为HCC治疗提供新的靶点。

微RNA； 癌， 肝细胞； 综述

1 肝细胞癌的诊疗现状

肝细胞癌 (HCC)发病率高、预后差，在世界范围内，其发病率居恶性肿瘤第五位，病死率居第三位[1]。HCC的诊断方法包括超声、多层螺旋CT、核磁共振、肿瘤标志物等，但早期诊断率很低，首诊的手术切除率仅为10%～20%，80%以上的患者确诊时已失去手术机会。除了早期诊断困难，HCC患者易发生肝内转移，根治性手术后复发率高达70%以上。据统计，我国肝细胞癌患者的5年相对生存率仅为10.1%[2]。目前，HCC的复发和转移是限制肝癌治疗的瓶颈，所以寻找可靠的血清学标志物和新的特异性基因治疗靶点是当前急需解决的问题。

2 miRNA的生物学特性

miRNA是一类广泛存在于真核生物中的内源性非编码小RNA分子，起初经RNA多聚酶II从miRNA基因转录生成初级miRNA，再经Drosha和Dicer 等内切酶处理，最终生成约22 nt大小的单链成熟miRNA。成熟miRNA与靶基因mRNA3′非翻译区域(3′UTR)上的结合位点互补结合后抑制靶mRNA的翻译或使得靶mRNA降解，从而在翻译水平上调控靶基因mRNA的表达[3]。在植物体内，miRNA需与靶mRNA完全互补，而在哺乳动物中二者也可以不完全互补配对。随着对miRNA的深入研究，人们发现这种转录后水平上的基因调控在人类恶性肿瘤的发生、发展和转移中起着重要作用。

3 let-7家族与HCC相关的调控机制

let-7最早是Lee等[4-5]在线虫体内发现的一种miRNA，包括let-7a-1、-7a-2、-7a-3、-7b、-7c、-7d、-7e、-7f-1、-7f-2、-7g、-7i、miRNA-202和miRNA-98 等13个家族成员。成熟let-7在胚胎干细胞中的表达是缺失的，随着细胞分化，其表达量逐渐增加，因此认为成熟let-7是细胞分化的标志[6]。目前let-7在HCC中的研究进展如下：

3.1 血清中let-7与 HCC的分子诊断 miRNA存在于血清等体液中，不被RNA酶降解，因而能够成为某些疾病的血清学标志物。let-7i在肝硬化和HCC患者血清中有明显的表达差异[7]。HCC患者血清中 let-7a和let-7f的表达水平明显高于正常对照组和慢性肝炎组[8]。多数研究证实let-7在HCC组织细胞中呈低表达，而在血清中呈高表达。原因可能是：(1)HCC组织中的let-7表达受到抑制后，通过某种途径释放入血；(2)某种细胞可以分泌一种物质募集肝组织细胞中的let-7入血，从而减弱let-7的抑癌作用。无论是哪种调控机制，let-7家族都有望成为HCC早期诊断的血清学标志物[9]。

3.2 let-7的上游调控基因研究 Lin28 是保持细胞干性的重要标志物，能促进癌细胞增殖[10]。在表达HBx的HepG2细胞中，Lin28B呈高表达，通过c-Myc形成HBx- c-Myc-Lin28B- let-7调节轴[11]；相反，Lin28A/B表达上调会增强let-7的靶基因c-Myc和HMGA2的表达[12]，从侧面说明Lin28对let-7的抑制作用。更复杂的是，研究发现上述调控通路是双向调节的闭合环路，即c-Myc/Lin28B-let-7-c-Myc/Lin28B[11]，该正反馈环路能够高效地发挥调控作用，同时也说明Lin28B是HBV感染合并HCC患者治疗的一个新方向。

长链非编码RNA(lncRNA)可以类似海绵作用特异地结合在miRNA上，但并不引起靶miRNA的降解。CCAT1属于lncRNA的一种，研究发现在稳定转染野生型CCAT1的细胞中，let-7的靶基因高迁移率组蛋白(high-mobility group A,HMGA)2和c-Myc可表达上调，并与HCC的肿瘤大小、微血管侵袭、AFP水平及预后密切相关[13]。通过结合位点抑制实验，CCAT1竞争性地结合在let-7的结合位点，抑制let-7抑癌作用，但并不引起let-7降解[13]。此外，也有对胃癌和结直肠癌的研究[14-15]发现let-7的靶基因c-Myc能结合在CCAT1的启动子区域，促进其转录。所以，let-7-c-Myc和CCAT1之间可能是相互调节，以实现级联放大效应，此研究在HCC中尚未见报道。

3.3 let-7通过下游调控基因抑制癌细胞增殖、转移

3.3.1 let-7c-CDC25A-CDK6/cyclinD1通路调控细胞周期

CDC25A是重要的细胞周期调控因子，可以去除CDK(如CDK2、CDK4、CDK6)的磷酸化作用，促进细胞从G1期向S期过渡，从而加快细胞周期进程[16-17]。CDC25A是let-7c的直接靶基因，在多种肿瘤中呈高表达[18-20]；荧光素酶报告基因实验[21]证实let-7c能结合G1期重要调控子cyclinD1、cyclinD2、CDK6的3′UTR，抑制其表达，使处于G1期的细胞比例增加，进而抑制HCC细胞增殖。这一发现在实体动物模型中也得到了验证[22]。肿瘤细胞的增殖归根结底是细胞周期调控失常的原因，因此细胞周期调控可能是肿瘤发生过程的必须环节，也是攻克癌细胞的关键。

3.3.2 let-7g-c-Myc-Bmi-1-p16通路与HCC迁徙 Lan等[23]研究发现let-7g能够下调c-Myc的表达，使抑癌基因 p16INK4A (CDK4激酶抑制剂)表达上调，最终抑制HCC增殖、扩散。敲除内皮细胞的c-Myc之后，Bmi-1表达下调，p16表达上调，所以c-Myc是通过调节Bmi-1间接调节p16表达，形成c-Myc-Bmi-1-p16通路调控HCC转移[24]。实验[6,13,25]证实HMGA2也是let-7g的下游靶基因，let-7g除了靶向抑制HMGA2的转录和翻译，还可上调p16表达，从而间接抑制HCC细胞增殖[26]。此外，let-7g能在转录水平抑制HBV的preS2蛋白表达和病毒复制，发挥抗病毒作用[27]。Ji等[28]证实Ⅰ型胶原α2(COL1A2)是let-7g的靶基因，COL1A2可以逆转let-7g对细胞迁徙的抑制效应。总之，let-7g在抑制HCC的增殖、侵袭、转移过程中扮演重要角色，有望成为HCC早期诊断，判断预后的标志以及HCC治疗的新靶点。

3.3.3 let-7i-IGF1受体(IGF1R)/IGF2 mRNA结合蛋白(IGF2BP)与HCC侵袭 IGF2BP包括IGF2BP1、 IGF2BP2、IGF2BP3， 可以与IGF1R (胰岛素样生长因子1受体) 结合促进肿瘤的发生、发展。Fawzy等[29-30]敲除IGF1R之后，HuH-7 细胞的增殖、侵袭明显受到抑制，也验证了这一理论。转染了let-7i的HuH7中IGF2BPs的转录受到抑制，IGF2BP被认为是let-7i的一个靶基因[31]。此外有实验发现[30]，let-7i高表达会使IGF1R表达降低，证明IGF1R也可能是let-7i的直接靶基因，敲除IGF2BP之后，IGF1R和其蛋白质的表达水平都降低。let-7i可能通过3种途径调节:(1)let-7i可以直接作用于IGF1R;(2)let-7i可以直接作用于IGF2BP;(3)let-7i可以通过扰乱IGF1R与IGF2BP之间的结合作用，最终效果都是抑制肿瘤细胞生长。但是以哪种调控为主，现在还不得而知。有趣的是，还有研究[32-33]证实c-Myc是IGF2BP的一个靶基因，表明let-7家族在HCC的发生发展中主要起抑制作用，但其中的调控通路如同网络一般错综复杂。

3.4 let-7家族参与HCC多药耐药

3.4.1 let-7b调控HCC对5-氟脲嘧啶(5-Fu)的敏感性 B淋巴细胞瘤-xl(B-cell lymphoma-extra large，Bcl-xl)是Bcl-2家族的一员，具有抗凋亡作用。研究[34]发现Bcl-xl 上存在let-7b的结合位点，在正常情况下Bcl-xl的表达被let-7b抑制。SNP rs3208684 (A>C)变异可以阻碍let-7b与 Bcl-xl结合，发挥Bcl-xl的抗凋亡作用。稳定转染野生型Bcl-xl可增加细胞对5-Fu的敏感性；而稳转突变型Bcl-xl可降低5-Fu的敏感性[35]，let-7b可以通过抑制Bcl-xl，间接增加HCC对5-Fu的敏感性，因而可作为判断5-Fu治疗效果的一项重要指标。

3.4.2 let-7c逆转HCC细胞多耐药 c-Myc基因是let-7c的直接下游靶基因，与HCC的耐药机制相关。袁媛等[36]用let-7c 模拟物使细胞内let-7c表达上调，发现能靶向抑制c-Myc，抑制HepG2/5-Fu细胞增殖，促进其凋亡,提高HepG2/5-Fu对多种化疗药物的敏感性，有趣的是，let-7c 抑制剂转染后出现了反向结果，说明let-7c 模拟物使let-7c在HepG2/5-Fu细胞内高表达后，能靶向下调c-Myc的表达,从而提高HepG2/5-Fu对多种化疗药物的敏感性，进而逆转多药耐药。Liu等[37]通过转染miRNA-199a-5p-let-7c的细胞实验发现let-7c和miRNA-199a-5p协同作用能下调癌基因MAP4KA的表达，不仅能抑制肝癌细胞侵袭和转移，还能提高肝癌细胞对索拉非尼的敏感性。以上实验结果说明let-7c与HCC细胞的多耐药密切相关，遗憾的是这一结果只是停留在体外培养细胞水平，还没有进入大量的动物实验和临床试验，如果let-7c的研究结果能投入临床阶段使用，将会是HCC治疗史上的一次重大突破。

4 前景与展望

早期诊断困难、易发生肝内转移和手术后复发率高是导致肝癌患者预后不良的主要原因，随着对基因调控过程的深入研究，人们发现肿瘤的发生、发展是原癌基因激活和抑癌基因失活、基因调控网络失衡的结果。let-7作为调控基因表达的一类miRNA,在肝癌细胞的侵袭和转移过程发挥重要作用，目前对let-7在HCC中调控作用的研究尚处于起步阶段，相信未来随着大量调控通路被发现和阐明，let-7以及其他miRNA有望成为恶性肿瘤早期诊断的血清学标志物，并为基因靶向治疗提供新的特异性靶点。

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引证本文：HUO TT, WANG DX, ZHANG MZ, et al. Mechanism and significance of let-7 in diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma[J]. J Clin Hepatol, 2017, 33(7): 1377-1380. (in Chinese) 霍婷婷， 王东旭， 张明智， 等. let-7在肝细胞癌诊疗中的机制及意义[J]. 临床肝胆病杂志, 2017, 33(7): 1377-1380.

(本文编辑：王 莹)

Mechanism and significance of let-7 in diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma

HUOTingting,WANGDongxu,ZHANGMingzhi,etal.

(DepartmentofOncology,TheFirstAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

MicroRNA (miRNA) play important roles in post-transcriptional gene regulation. In recent years, miRNA has become a hot topic in the research on the development and progression of tumors, and gene targeting therapy for malignant tumors has achieved preliminary progress. As one of the first discovered miRNA, let-7 can regulate the cell cycle and angiogenesis and is involved in the proliferation, differentiation, and apoptosis of various tumor cells. Most members of the let-7 family can act as tumor suppressor gene and have low expression in various tumor tissues and high expression in the serum of patients with malignant tumors. Let-7 is closely associated with the invasion and drug resistance of hepatocellular carcinoma (HCC). The studies above show that let-7 might become a new marker for the early diagnosis of HCC and provide new targets for the treatment of HCC.

microRNAs; let-7; carcinoma, hepatocellular; review

10.3969/j.issn.1001-5256.2017.07.039

2017-02-27；

2017-03-13。

国家自然科学基金(81272375)

霍婷婷(1991-)，女，主要从事肝细胞癌方面的研究

赵磊，电子信箱：drzhaolei@hotmail.com。

R735.7

A

1001-5256(2017)07-1377-04