实时荧光定量PCR非特异性分析*

姜文灿，岳素文，何赏，陈琛，孙慧珍，江洪，王成彬

(1.中国人民解放军总医院临检科，北京 100853；2.北京泰格瑞分子检验有限公司，北京 100085；3.温州医科大学检验医学院/生命科学学院，温州 325000 )

·专题笔谈·

实时荧光定量PCR非特异性分析*

姜文灿1,3，岳素文2，何赏1，陈琛1，孙慧珍1，江洪2，王成彬1,3

(1.中国人民解放军总医院临检科，北京 100853；2.北京泰格瑞分子检验有限公司，北京 100085；3.温州医科大学检验医学院/生命科学学院，温州 325000 )

聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)因灵敏度高、操作简便在各个领域得到了广泛的应用。然而，伴随其高灵敏度存在的非特异性问题在一定程度上限制了其应用。不同于普通检测方法，该技术的非特异性问题主要由可以指数扩增的引物二聚体(primer dimer, PD)引起。对此，引物设计时使用的中部同序引物对可以从根本上避免PD的产生，从而解决由其引起的非特异性问题。该文从PCR的发展和本质、PCR非特异性产生的原因和应对策略等方面作一总结及分析。

实时荧光定量PCR；非特异性；引物二聚体

聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)是在体外模拟体内核酸复制过程从而达到快速核酸检测目的的一门核心技术，相比于一般信号叠加的检测方法，其具有指数放大的模式使灵敏度提升了上百万倍。实时荧光定量PCR在传统PCR基础上加入信号系统对反应过程进行实时监测，继承了传统PCR灵敏度高和操作简便的特点，实现了对样本的定量检测，并进一步提升了PCR技术的灵敏度。该技术在医药卫生、生物科学、农业科学等方面得到了广泛的应用[1-3]。然而，在进行PCR检测时，其难以克服的非特异性问题在一定程度上限制了该技术的进一步临床应用。因此，本文从PCR的发展、非特异性问题产生的原因及解决非特异性问题进行讨论，并以常用的探针法实时荧光定量PCR作为对象进行分析。

1 PCR技术的发展和本质

PCR非特异性问题与其发展历史和PCR的本质密不可分。1953年Watson建立的DNA双螺旋模型及半保留复制法则奠定了PCR扩增的分子基础；1971年Khorana等[4]发表了1篇核酸体外扩增相关论文；1985年，Wittwer等[5]根据指数扩增或几何级数式放大的能力，发明了由一对特异引物结合、复制靶分子基因，体外(于试管内)模拟天然基因半保留复制的PCR扩增技术。然而，因同样起始量的样本经PCR级联放大以后变化太大而产量不均一，致使常规终末PCR难以定量检测。1997年，采用动态实时检测扩增对数期的循环数与靶初始量成反比(反对数关系)的封闭荧光定量PCR技术诞生。根据发光原理的不同，该技术主要分为荧光染料法PCR和各种荧光核酸探针PCR两大类[6]。

靶分子数量以2n级数激增，是PCR最核心的本质。常规PCR通常进行30个热循环，而230约等于109，靶模板以如此高的扩增速度扩增是一般线性放大检测方法无可比拟的，其灵敏度也远远大于普通的检测方法。现阶段使用的实时荧光定量PCR技术通常反应40个循环，检测灵敏度可达飞克级(10-15g)水平或数个分子。这也是PCR成为应用最广、最核心技术的根本原因。此外，其指数放大亦伴随PCR高度的特异性，PCR特异性直接由引物的特异性决定，引物一端的非特异错配扩增甚至完全配对扩增也仅是线性增大，自然远远赶不上指数扩增或几何级数放大。另外，引物特异性少量的降低或与靶序列微弱的不匹配虽然也会导致扩增速率的下降，但这远远赶不上特异的指数或几何级数放大，换而言之，靶模板进行指数扩增或几何级数放大即可保证PCR扩增检测的高特异性。除此之外，PCR的熔解曲线也具有极高的特异性，靶扩增产物显示典型狭窄变性温度，即特定Tm值。探针法PCR通过增加一条结合探针使特异性更有保证，但在多数情况下普通PCR的特异性已经足够，因此PCR非特异性也主要由指数放大或几何放大这一本质决定。

2 PCR非特异性产生的原因

2.1 引物模板非特异性结合 超灵敏且呈几何级数放大的PCR技术在带来高灵敏度检测的同时也带来难以克服的非特异障碍，如引物在低温条件下非特异性结合模板所导致的非特异扩增等。然而，一方面，Taq酶在低于40 ℃时的环境中活性很低，不足以引起PCR出现非特异性扩增；另一方面，PCR反应中仅一条引物与其他模板结合引起的非特异线性扩增为线性扩增，不能与靶模板的特异性指数扩增相比。故而低温启动不是非特异性出现的关键原因。

2.2 引物二聚体(primer dimer, PD) PD是由引物间互为模板、互为引物所形成的，其指数扩增是引起PCR非特异性的根本原因，也是PCR反应非特异性难以克服的根本原因。一般3′末端数个碱基连续反向互补的引物，在不加模板的本底染料法PCR扩增反应中，约在几个至十几个循环处即出现可见的PD扩增；一对常规设计的引物本底PCR反应的Ct值在30左右(这也是普通PCR只进行30个循环反应的主要原因)。染料法实时荧光定量PCR所使用的嵌合染料可结合任何双链产物，而反应体系中PD在经过30个热循环之后出现明显的指数扩增，因此PD的Ct值多在30左右，从而致使Ct值在30～38之间的低浓度靶分子无法区分是PD还是扩增产物(检测时Ct值均显示为30)。探针法实时荧光定量PCR中靶特异探针虽可绕开PD引起的假阳性，但高浓度的PD可与靶模板竞争靶引物，抑制了引物同低浓度靶模板的结合，从而限制了其检测的灵敏度。

2.3 汽雾胶污染 荧光定量PCR进程中，除螺旋盖毛细管外，所谓的“闭管分析”多数情况下并不完全密闭，大多数0.2 mL PCR试管或96孔板，在热循环95 ℃变性时，高温高压下就会有一些气雾胶溢(挤)出管盖。气雾胶不仅含高浓度已扩增的阳性靶分子，更多的是一对过量引物间产生的小分子PD或引物-探针聚合体, 且每一个检测反应管/孔都会产生PD非特异性指数扩增。随着重复，泄漏的污染物会反复地进行指数扩增、积聚，随后的实时荧光定量PCR不是从第1个循环开始而是从上次PCR结束循环数开始，由此PCR污染物越来越严重。

除上述情况外，常规PCR检测中也会出现由于其他原因所造成的非特异性扩增，但均为非指数扩增，因此，只有一对引物均为非特异结合、延伸的扩增才能引起非特异性指数的扩增。PCR反应的非特异性包括内生PD和外源气雾胶两个方面，二者也会相互影响，内生PD非特异性之源不消除就难以判断气雾胶控制效果；反之外源气雾胶不控制就难以消除内源PD引起的PCR非特异性。

3 解决PCR非特异性的策略

3.1 引物设计 在PCR体系稳定的情况下，真正决定模板能否实现扩增的关键程序为引物设计。同样，克服PCR非特异性的首要方法应从引物设计入手。引物引起的指数非特异性主要源于其碱基序列，一对完全同序的引物绝对没有引物非特异性。相同标签辅助-无引物二聚体(homo-tag assisted non-dimer, HAND)技术采用完全同序引物标签，通过引物二聚体单链5′端自身结合形成二级机构，抑制其与游离引物的结合,但该方法不仅显著抑制PD的扩增,也没有选择性地减低了靶模板特异性扩增效率[7]。与此不同，另有学者根据一对完全同序引物绝没有非特异性的现象，采用部分同序引物抑制PD的扩增，将“同序”置于引物中部偏3′端，能最大化地选择性抑制PD扩增而不影响靶扩增效率[8]；PCR体系中添加与引物中部同序部位配对结合的含反义碱基的Oligo，反义碱基的存在使其不能作为模板和非特异性延伸的起点，能进一步特异性地选择放大对PD抑制的作用。在无3′末端反向互补常规引物设计原则基础上，选择中部6～8个碱基同序引物对和结合中部8～10个反义碱基Oligo在实时荧光定量PCR的40个循环反应内，没有PD非特异性扩增的干扰。配合矿物油封闭下的PCR成份缓释策略，将彻底杜绝PD非特异性，通常选择一端引物溶于高比重粘糖溶液并预先加入PCR管底部，再小心加入PCR其他成份反应液及封闭油并保持一段时间分层，待PCR热变性自动混匀热启动；加矿物油封闭不影响荧光光路但要避免热盖下的油面上溅起的PCR反应液出现热循环扩增及泄露，若出现反应液泄露，也可由于缺少一端引物而成为无效的扩增及泄露。

3.2 反应体系优化及技术改进 目前，各种控制非特异的措施如变化PCR组分、添加各种化学试剂等均得到一定程度的应用。例如单链结合蛋白(single strand binding-protein,SSB)、基因32蛋白和引物结合反义碱基Oligo的使用，但其对特异与非特异扩增基本是平行的，显著抑制PCR非特异性的同时也不同程度地干扰了靶特异性扩增效率。此外，对反应体系使用热启动的策略也可以在一定程度上减轻非特异性问题，具体措施包括：蜡包中Mg2+离子热释放、聚合酶Taq修饰抑制(包括端N缺失的KlenTaq, 抗Taq酶抗体和Taq酶抑制寡核苷酸Aptamar，以及四氧化戊烷热激活引物)等[9-11]。但多数低温热启动作用有限，仅可以将非特异性扩增推后1～2个循环，并不能解决后续的非特异性产物的指数扩增。而传统使用的PCR预变性后手工加入PCR反应组分的绝对热启动策略对非特异性出现的本底Ct值也仅推后1～3个循环。

3.3 其他 为了控制产物气雾胶污染，现在采用的策略还包括过滤系统、产品生产质量管理规范(good manufacturing practice，GMP)车间、P3/P4实验室，然而扩增产物气雾胶再污染仅靠过滤系统、GMP车间、P3/P4实验室是隔绝不了的。对于气雾胶再污染，可采用dUTP代替dTTP产物再结合尿嘧啶-DNA-糖基酶(UDG/UNG)降解绝大部分扩增产物的策略，但该方法对反应过程中新产生的PD作用有限。

不设置热盖的PCR仪器荧光光路必须均位于管底横向读取荧光，否则油面上的溅起液冷凝至管盖会遮挡荧光。独立设置的扩增室或物理隔绝的PCR仪器是防止外源气雾胶再污染的最可靠策略。

4 荧光探针PCR非特异性

以最常用的TaqMan探针法实时荧光定量PCR为例，体系中引入一靶特异荧光标记探针，一方面靶探针不针对引物序列而不会结合PD非特异扩增产物，增加了一定的特异性。但PD的扩增在探针法PCR中不可见并不代表其不存在或不起作用，同引物双重PCR相互间严重干扰、抑制；在共同引物的双靶分子扩增条件下，浓度降低10倍的靶模板的扩增会被高浓度靶分子彻底抑制；本底Ct值为30的PD扩增竞争性抑制低一个数量级的低浓度靶分子扩增，PD非特异性降低了PCR系统灵敏度，低浓度样本结果产生假阴性反应[12-13]。采用中部同序引物推后本底Ct值也有助于提升探针法PCR的灵敏度。

另一方面，过量引物与探针之间也产生一定程度的非特异聚合、延伸的扩增，不加靶模板的PCR本底系统，一对引物与荧光标记TaqMan探针可产生Ct值为33～35的非特异性扩增曲线，且随着反复的重复同一PCR扩增，其扩增平台期荧光吸收峰值越来越高， Ct值也逐渐前移，产生一定的假阳性。探针自身两两结合的解链式TaqMan/水解探针(中国专利CN201510961208.4)一定程度有助于降低探针法PCR本底扩增[14]。

由于一些如血液、泥土等样本及提取时残留的PCR抑制成分干扰或抑制PCR样本检测而产生假阴性反应。从2000年开始逐步出现不同荧光波长的内标扩增的探针法PCR报道，如通过内标基因扩增监测PCR抑制剂成分所造成的假阴性[15]；到2010年采用管家基因等不同靶序列的内标扩增探针法PCR成为常规标准程序。然而，不同序列的双引物双重PCR也存在一定相互干扰、抑制，低浓度的靶扩增逐渐被高浓度的靶分子所抑制，不同引物的内标扩增非竞争性抑制更低浓度靶分子扩增和引物—探针间聚合的非特异本底扩增[16]。结果客观上使所有阴性样本全部阴性反应，商业探针法PCR试剂盒表面上看灵敏度高且没有假阳性，而其本质为内标基因的存在抑制了引物—探针聚合产生的非特异性。过量的内标扩增反而增加了系统假阴性，内标的用量也尚无行业标准。

内标增加了系统复杂性。内标引物与靶引物更加容易形成PD及多聚合扩增，非特异性本底Ct值(约为30)进一步前移，使PCR系统灵敏度进一步降低，反而提高了系统假阴性程度，然而，内标用以监测PCR抑制所导致的假阴性出现，却增加了假阴性。但降低PD非特异性的中部同序优化引物和调整本底至Ct值近30时的对照内标仍有一定的应用效果。样本中抑制剂的监测可通过样本添加模板质粒、染料法PCR熔解曲线分析，或者调整PCR反应基线来监测，能上下波动的扩增基线显示PCR没有抑制。

5 展望

PCR技术自推出以来得到了飞速发展和广泛应用，显示了其强大的生命力和发展潜力。由于其灵敏、特异、操作简便等特点，现已成为分子检测的核心技术之一，随着该技术的普及，免疫结合PCR的分子诊断技术将得到推广。如今，大批科研工作者基于核酸扩增原理对这一技术进行了不断深入的研究和改良，使其特性得到了进一步的完善，并推出来其他核酸扩增技术。随着科技的发展，检测更准确、更迅速的PCR扩增仪将不断被推出，联合不断革新的软件分析技术，该技术将得到进一步的推广和应用。

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(本文编辑：许晓蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.05.14

国家重大科学仪器设备开发专项(2012YQ03026107)。

姜文灿，1992年生，男，硕士研究生，主要从事分子生物学研究。

王成彬，主任医师，教授，博士研究生导师，E-mail: wangcbin301@163.com；江洪，博士，E-mail: tagarray@163.com。

R446.6

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2017-02-07)