结核杆菌实验室检测技术与临床应用进展

严芝光，周丽

（广西壮族自治区防城港市第一人民医院，广西 防城港 538021）

综述

结核杆菌实验室检测技术与临床应用进展

严芝光，周丽

（广西壮族自治区防城港市第一人民医院，广西 防城港 538021）

结核病是由结核杆菌感染引起的慢性传染病。本文就结核杆菌实验室检测技术与其临床实际应用做如下综述。

肺结核；结核分枝杆菌；检验技术；诊断

结核病是一种严重危害人类健康的慢性传染病，由结核分枝杆菌（MTB）感染而引起。据世界卫生组织（World Health Organization, WHO）统计我国是全世界22个结核病流行严重的国家之一[1]，患结核病人数居世界第2位。目前，结核病诊断手段归纳有以下3个方面：①实验室诊断技术；②影像学诊断技术；③治疗性诊断手段。结核分枝杆菌可以累及全身各个系统，造成了结核病的临床表现多样，尤其是肺外结核病变的诊断手段比较少，给临床诊断带来极大的困难，同时由于各种诊断方法的敏感性与特异性不高，导致结核病的控制更加复杂、困难。因此，在结核病实际防治工作当中，如何提高疾病的早期诊治成为控制结核病发生的关键环节。随着当前医疗水平的提高，实验室检测技术在结核病诊治方面体现出重要作用。为此，本文就结核杆菌实验室检测技术与其临床实际应用状况进行如下综述。

1 微生物学检测技术及应用

1.1 涂片染色技术

1.1.1 萋尼氏抗酸染色法（Z-N-AFS） Z-N-AFS具体操作是利用抗酸染液对痰涂片进行染色处理，让后将其置于普通光学显微镜下进行镜检，每张Z-N染色痰涂片阅片时间约为5 min。此方法具有多种优点，如操作简便、价格低廉、检测时间短、特异度高等，因此，是当前广泛用于结核病实验室检查的一项常用的诊断技术，同时是WHO推荐使用的结核病诊断技术之一。该方法的缺陷是敏感性较低，且存在不能有效区分结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的缺点。国外有文献[2]报道Z-N-AFS敏感性仅占0%-44%；王震等[3]报道Z-N-AFS敏感性为35.29%；文献[4,5]报道Z-N-AFS敏感性为13.85%-22.90%。

1.1.2 免疫磁珠捕获抗酸染色法（IMC-AFS） 取捕获处理后的免疫磁珠加小牛血清混匀后进行AFS制片，染色干燥后镜检。王震等[5]报道IMC-AFS敏感性为43.14%，比Z-NAFS敏感性提高，特异性相似；杨江华[6]报道IMC-AFS将有助于提高痰菌阴性结核病的诊断效率。该方法同样具有检验时间短、操作较简单、价格低、特异度高等优点；缺陷与Z-N法相似。

1.1.3 荧光染色镜检法 其原理为：对抗酸杆菌进行荧光染色后，与菌体结合的染料可被特定波长的光线激发后产生荧光亮点，要求观察50个视野，读片时间为1 min-3 min。国外相关研究[7]指出，此方法在提高抗酸杆菌10%检出率的同时能够保持相似的特异度。随着当前科学技术的发展，LED光源、荧光显微镜技术的发光二极管（LED）荧光显微镜应运而生，在2011年，卫生组织将其作为取代传统荧光显微镜的技术，同时将其替代了以Z-N染色为基础的传统光学显微镜检测法。与传统的荧光显微镜相比，LED价格更低、使用寿命长，使用相对简便。最近又发展了建立在荧光染色基础上的全自动化读片系统TBDx，通过将荧光染色后的涂片标本置于TBDx系统内，便会自动读取数据、报告检验结果；该系统每张涂片的读片分析时间为5 min-6 min，其诊断准确率与专业人员判断结果无显著差异[8]。

1.2 结核菌培养技术

1.2.1 改良罗氏培养法（L-J） 目前，结核分枝杆菌培养已被认证为结核分枝杆菌检测、药敏试验的金标准。结核杆菌诊断的经典方法是改良罗氏培养法。李宁等[9]报道的L-J法培养阳性率是7.1%，体现出此方法的多种应用特点，如实验费用低、有效保持细菌形态、可清晰地观察菌落形成过程、便于对菌落施以菌型鉴定与耐药性试验等，然而由于耗时长（阴性报告需观察8周）、敏感性不高等问题的存在，限制其实际应用。

1.2.2 结核杆菌快速培养法 多数结核杆菌快速培养技术是由美国BD公司生产的Bactec MGIT960TB检测系统，此系统是一款全自动分枝杆菌培养仪，具备快速培养、检测及药敏技术，作用原理如下：采用分枝杆菌生长指示管法（MGIT），即在Middebrook7H9液体培养管中包埋有对氧浓度变化高度敏感的荧光显示剂，以测定氧浓度变化为依据，对分支杆菌生长状态进行检测；一旦氧分子被消耗，便会出现培养基氧化还原电势呈降低趋势，而显示剂则出现荧光，提示结果呈阳性。该技术敏感度高、检测速度快，1周-3周即可检测到分枝杆菌的生长。王馨[10]报道的阳性率为70.05%，Katila等[11]报道的阳性率为82.5%-94%。由此可知，此方法具有检测时间短、检出率高、特异性强等特点，但仪器、试剂昂贵，不易在基层诊治单位推广。

2 免疫血清学检测技术及应用

2.1 斑点免疫胶体金法（DIFA） 其作用原理如下：通过把分离纯化的MTB特异性外膜蛋白/LAM点样，加以固化在硝酸纤维膜载体上，对人血清内MTB IgG抗体进行捕获，并使用葡萄球菌A蛋白（SPA）胶体金缀合物进行标记，反应时间15 min。王震等[3]报道该法特异性为70.00%，敏感性为60.78%；王志佳等[12]报道该法特异性为80.9%，敏感性为73.9%。DIFA法具有结果快速、可靠、操作简单、不需进行镜下观察，适用于普通人群普查快速检测和流行病学的调查。

2.2 免疫色谱法 免疫色谱法在临床上应用十分广泛，该法与胶体金法的检测方法基本一致，即非结核分枝杆菌不能分泌MPB64蛋白，但结核分枝杆菌可以有效分泌MPB64蛋白，进而达到鉴别区分目的[13]。卫生组织提出，在临床实际工作中可以通过结合免疫色谱法、液体培养鉴定分枝杆菌展开菌群，在成功分离培养结合分枝杆菌的同时也可以及时满足药敏试验实际需求[14]。王军喜[15]报道，对结核分枝杆菌复合群进行免疫色普法检测，经统计分析可知灵敏度、特异度、阳性预期值、阴性预期值分别是98.5%、100.0%、100.0%、97.7%；免疫色谱法比胶体金法的临床优越性更为显著，但是检测成本比胶体金法本高。

2.3 酶联免疫吸附法（ELISA） 多采用间接法。原理为：经结核杆菌纯化蛋白衍生物（PPD）或细胞壁成分阿拉伯甘露聚糖脂（LAM）或重组的特异性蛋白质抗原包被聚苯乙烯微孔板，与待检血清及酶标抗人IgG抗体形成抗原抗体复合物，呈色反应与抗结核杆菌抗体的水平成正比。国内资料[16]报道该法敏感性为88.5%，特异性为97.3%。目前，ELISA法检测已成为临床用于检测结核杆菌感染的重要免疫血清学检测方法之一，在结核病诊断、应用等方面得到普遍应用。

2.4 干扰素体外释放酶联免疫法 作用原理如下：通过将致病性结核分枝杆菌特有的RD1区编码早期分泌靶向抗原6-kd（ESAT-6）、培养滤过蛋白10（CFP10）肽段库作为抗原，对全血标本内结核抗原特异性T细胞起到刺激作用，促进免疫应答的产生，干扰素的分泌，然后利用酶联免疫反应检测结核特异性效应T细胞，从而判断待检者是否感染结核分枝杆菌及感应程度的方法。该方法以英国Oxford公司生产的T-SPOT.TB试剂盒及北京万泰公司生产的TBIGRA试剂盒为代表。TB-IGRA和T-SPOT.TB检测方法在灵敏度和特异度差异上无统计学意义[17]。其临床应用价值在于：①对肺内、肺外结核患者具备较高的阳性率和特异性。钟靖等[18]报道γ-干扰素释放试验对肺外结核的灵敏度为92.0%，特异性为94.0%；临床局限性在于：①干扰素释放试验检测费用相对较高，不适用经济不发达、贫困等地区的应用；②干扰素释放试验难以对结核病的发生、发展等状况作出良好的预测评估，加之临床数据原因，就≤5个患者而言，难以提供更加精确的评价指标[19]。

3 分子生物学检测技术及应用

3.1 Xpert MTB/RIF技术 Xpert MTB/RIF试验是美国Cepheid公司研发的分子检测技术，其以全自动半巢式实时PCR技术为基础、以rpoB基因耐药决定区为靶基因，能够在2 h内通过对分枝杆菌（MTB）、利福平（RIF）耐药性进行检测。新英格兰杂志公布的研究结果表明以培养法为参考标准Xpert MTB/RIF的特异性为99.2%，敏感性为92.2%，2010年WHO首次推荐Xpert MTB/RIF技术的使用。由此可知，Xpert MTB/RIF技术在MTB、RIF耐药性方面的特异性、敏感性均较高，充分体现出其操作简便、监测结果精准等特点，值得在结核病诊疗机构中进行大力推广、使用。

3.2 聚合酶链反应（PCR）技术 其原理如下：通过以人工合成的寡核苷酸片段为引物、以待扩增的DNA分子为模板，促使目的片段经DNA聚合酶作用进行延伸，直至完成新DNA的合成。常用的有普通PCR技术、聚合酶链反应荧光探针技术和免疫磁珠捕获聚合酶链反应技术（IMCPCR-ELIST）等。陆云鸥等报道[20]PCR荧光探针法的的阳性率与BD960液体培养法差异无统计学意义，仅需1 d就可以得到结果。可见，PCR技术的应用效果理想，一方面可以保持检测快速简便，另一方面能够提高检测阳性率，便于结核病患者得到早期诊治，尤其是抗酸染色阴性的活动性结核病患者。

3.3 重组酶聚合酶等温扩增技术（RPA） RPA是一种新型的恒温扩增技术，可以有效弥补PCR反应过程精准热循环的缺陷，即仅在恒温环境下便可成功实现核酸分子扩增反应，RPA反应速度较快，一般从开始到完成只需5 min-15 min，而扩增产物可通过实时荧光、琼脂糖电泳或金标记免疫反应等方法检测。体现出RPA技术操作简便、快速灵敏度高等特点，适合于床旁快速检测，有利于在基层单位或边远山区推广。

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