蛋白分离技术的应用和进展研究

蒋丹 曹宇虹 张海杰（正大天晴药业集团股份有限公司，江苏 南京 210000）

蛋白分离技术的应用和进展研究

蒋丹 曹宇虹 张海杰（正大天晴药业集团股份有限公司，江苏 南京 210000）

蛋白质存在一切生物体中，是作为生物体生命周期中一个重要的成分。所以对蛋白质的研究也是对生命科学研究探索的一个重要环节。

蛋白分离技术；提纯；层析法

随着生物医学的技术发展，分离制备天然高分子化合物的技术领域已趋向成熟，通过对天然高分子化合物这些具有较强生理活性物质进行生物制药。本文从沉淀分离法和亲和层析法等分离技术研究，推测后续的发展的状况。

1 沉淀分离法

(1)常用的分离蛋白方式是通过无机盐将蛋白溶液中的酶沉淀分离或是蛋白分离，这种方法是一种较为简单的粗分离法。大体思路是将35%-60%的硫酸铵加入到蛋白溶液中，在低温4℃存放24小时，然后通过离心力将蛋白分离出来。硫酸铵沉淀蛋白质的方式分离要注意在具有高浓度蛋白中进行。具体步骤可以由以下三种方法完成：（1）加入一定浓度的硫酸铵将蛋白溶液中的蛋白沉淀，使之与非蛋白杂质分离；（2）通过“馏分”将沉淀的蛋白质分出，让参有杂质的蛋白质存留在溶液中，使之无法沉淀；（3）采用能将蛋白溶解的溶液，再通过盐析的方法将杂质沉淀并将其分离，将蛋白质保留在纯净溶液中。

盐析法在实际中的应用有磷酸络氨酸蛋白专一抗体的转化，红茶抗菌蛋白纯化等，实际应用广泛，但分离过程中需消耗大量无机盐，易造成环境污染，所以在国际上很多国家已禁止该工艺的使用。

(2)有机溶剂沉淀法

作为沉淀分离蛋白的另一种方式，就是用有机溶剂代替了无机盐。通过C2H6O、CH3COCH3等有机溶液作为沉淀剂，沉淀剂先在4℃下预冷，再定量的加入到蛋白溶液中，通过离心法使之充分反应沉淀，再收集沉淀物。实际应用有全蝎蝎毒蛋白提取和SOD的分离制备等，这种方法虽然是降低了环境的污染，但是在制备的过程中易造成蛋白失活，且成本较高。制备过程要防范火灾和爆炸的发生。

(3)等电沉淀法

蛋白质带有净电荷，每个蛋白会存在一个pH值使蛋白表面的净电荷为零，称为等电点（PI）。在PI时蛋白质在水溶液中的溶解度最低，利用蛋白质的这个特性，可以将掺有蛋白的溶剂中蛋白总净电荷调到零，就能从溶液中析出蛋白沉淀。即使是蛋白等电沉淀所需要pH值和提取缓冲液pH值相差较大时也是可以完成的，酸性蛋白质也能在碱性的溶液中析出。但是具有中性等电点的蛋白质就需要在蒸馏水中完成透析的过程。在等电沉淀法中pH值和搅拌反应时间对回收纯度影响比较大。

(4)亲和沉淀法

亲和沉淀法具有亲和层析法的一些优点，并且经济有效。原理的是通过改变物理特性（pH值、温度和离子强度）使其发生可逆性沉淀的水溶性复合物，在利用分子和亲和高分子加热作用沉淀分离出目标分子，最终得到目标蛋白。过程如下：将亲和性热沉淀高分子材料和有溶菌酶、卵清蛋白的溶液融合，在一定的温度下均匀搅拌，直至蛋白质变成复合物，在升温沉淀，离心分离，再将得到的沉淀物溶解在醋酸中，再提高温度提出热沉淀高分子，通过离心分离即可得到溶菌酶和卵清蛋白。

2 亲和层析法

亲和层析是一种吸附层析，在层析的载体上有特殊亲和性的配基，这种配基可以在众多成分中有选择的选中吸附到某一层的层析载体，对其他没有选定的吸附力很小，可以很方便的在混合溶液中分离出单一成分。根据配体和目标分离产物作用力的差异可以分为免疫亲和层析法、生物性亲和层析和金属离子亲和层析等。

免疫亲和层析法是通过载体上的抗体或抗原的相互作用，这个作用力是一种强大的亲和力，在提取高纯度的抗原和抗体上贡献很大。多糖琼脂糖凝胶载体通过CNRr活化后与具有免疫亲和性的蛋白结合，产生的物质和N一羟基丁二酞亚胺作用，在具有抗体的溶液中反应，最后就能得到亲和载体，可用来分离抗体和抗原。比如纯化重组人促红细胞生成素和纯化新的骨肉瘤相关抗原等等。

生物性亲和层析主要是利用溶霉菌无法对底物类似物进行酶解的原理来分离溶菌酶。一般情况下通过酶解产物作为配基可以改变底物容易转为产物的缺点，在分离的效果上较为方便。在实验中使用溶菌酶分解细胞壁，所得的产物作为配体，再连接到琼脂糖中进行亲和层析，可以大大增加酶的提纯能力。不过酶和连接在载体上的酶之间的作用力要小于酶—底物的作用力，但也可以分离出目标酶，一般用来分离提纯粗酶产品，回收率较高。

配体亲和层析的分离程度较生物性亲和层析而言，其分离性能要差，但是有一定的独特性。若使用组氨酸固化到载体上作亲和层析，可以很好的去除溶液中各种分子量的热原，通过不同的载体亲和层析纯化出不同的酶，并且有极高的回收率。而在氨基酸或是多肽物质作为配基时拥有一定的独特性，表现在稳定性能的良好和成本的低廉。在制备的过程中即使配基与产物接触也不会出现免疫反应，不影响最终的产量，唯一不足的地方就是联合的匹配性要求较高，不容易找到相应匹配性产品。

3 今后发展

目前，传统的蛋白质分离方法在粗制分离生产中仍有大量应用，不过新技术亲和层析法较于传统技术而言，有较高简便性和提纯度，在今后的发展中有明确的发展方向。由于亲和层析技术的回收率高、提纯度高，在今后的研究中具有重大的意义，是开发利用的重要方向。

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