骨髓基质细胞移植对缺血性大鼠治疗效果及VEGF表达的影响

朱 磊 韩 丽 朱亚楠 龙翠英 郑春玲(通讯作者)

1)河南漯河市中心医院 漯河 462000 2)漯河医专二附院 漯河 462000

骨髓基质细胞移植对缺血性大鼠治疗效果及VEGF表达的影响

朱 磊1)韩 丽1)朱亚楠2)龙翠英1)郑春玲1)(通讯作者)

1)河南漯河市中心医院 漯河 462000 2)漯河医专二附院 漯河 462000

目的 研究骨髓基质细胞(BMSCs)对缺血性大鼠的治疗效果。方法 将30只成年雌性SD大鼠制备成大脑中动脉缺血2 h再灌注24 h动物模型，按随机原则分为对照组和实验组，对照组模型制备成功后，不给予任何干预，自由饮食。实验组于缺血再灌注24 h后经尾静脉给予BMSCs 3×106，所有大鼠于缺血再灌注1 d、3 d和7 d进行神经功能评分，免疫组化法测定VEGF表达水平。结果 神经功能评分：再灌注3 d、7 d后实验组神经功能评分明显低于梗死对照组(P<0.05)。VEGF免疫组织化学染色：再灌注后3 d、7 d实验组缺血区表达VEGF的细胞较梗死对照组明显增多(P<0.05)。结论 BMSCs可显著促进脑缺血大鼠的神经功能恢复，促进VEGF的表达，以减少神经细胞的凋亡。

脑梗死；大脑中动脉闭塞；骨髓基质细胞；血管内皮生长因子

近年来，脑卒中的发病率、致残率及病死率逐年增高。卫计委完成的《全国第三次死因回顾抽样调查报告》提示，脑血管病已上升为我国居民的首位死亡原因[1]。既往观点认为，神经细胞受损后不能再生，因此，目前缺血性脑卒中的溶栓、抗凝及营养神经等治疗手段不能有效修复损伤的神经细胞。而骨髓基质细胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)是一类多能干细胞，具有多向分化的性质[2]。研究显示BMSCs能改善多种中枢神经系统疾病的神经功能[3]，其在神经系统疾病中的应用前景越来越受到人们的关注。

1 材料与方法

1．1 材料 30只SD雌性大鼠，体质量(200±20)g，10%水合氯醛、4%多聚甲醛、PBS缓冲夜、2% TTC染液、3% H2O2溶液，碘伏、抗原修复液、VEGF一抗、兔二抗。

1．2 BMSCs制备 在无菌条件下取出SD大鼠双侧股骨，暴露骨髓腔。贴壁+胰酶消化法分离培养大鼠 BMSCs，取第4代细胞进行 Brdu标记，收集、调整浓度后备用。

1．3 动物分组、 造模、 移植 将 30只 SD大鼠均分为2组，各组动物均采用Zea-Longa线栓法制成右侧大脑中动脉梗死模型。实验组于建模成功后 24 h在严格无菌操作下进行 BMSCs移植，10%水合氯醛(3 mL/kg)腹腔注射麻醉大鼠，应用微量注射器将总体积1 mL的单细胞悬液(内含3×106个BMSCs)经大鼠尾静脉注入体内。对照组同法注入1 mL PBS。动物苏醒后送回笼内正常饲养。

1．4 神经功能评分 2组大鼠移植前及移植后1 d、3 d、7 d利用改良的神经严重程度记分(mNSS)评分法[3]进行神经功能评分，每次评分随机抽取6只大鼠，评分越高，神经功能损失越严重。

1．5 TTC染色 各组大鼠于移植后3 d、7 d，麻醉后取脑，置于-20 ℃冰箱15 min取出，做连续冠状切片，每片厚2 mm，给予TTC染色[4]。

1．6 HE染色 各组大鼠于移植后3 d、7 d，麻醉后灌注取脑，置于4%多聚甲醛固定，常规梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，3 μm厚连续冠状切片。HE染色、拍照、观察。

1．7 VEGF免疫组织化学染色 石蜡切片，脱蜡、脱水，用3% H2O2溶液灭活内源性酶，热抗原修复，滴加兔血清封闭液，滴加VEGF一抗(1∶100)4 ℃过夜，滴加生物素化兔二抗IgG，DAB显色，苏木素复染，脱水、透明、封片，结果判定。

2 结果

2．1 MCAO大鼠脑梗死形态学观察及神经功能评分

2．1．1 大鼠脑梗死形态学观察：SD大鼠经过大脑中动脉结扎(MCAO)后运动功能缺损如图1A所示。同时，MCAO脑组织切片经过TTC染色，形态学观察如图1B所示，切片中红色区域代表正常脑组织，白色区域代表梗死区域。

图1 MCAO大鼠脑梗死形态学观察 A：SD大鼠经大脑中动脉结扎后运动功能缺损 B：制备成功的MCAO大鼠脑组织切片行TTC染色，切片中正常区域染为红色，缺血梗死区域染为白色

2．1．2 大鼠神经功能评分结果：所有大鼠都于模型制备前以及梗死后1 d，给药后3 d、7 d分别给予mNSS 评分，结果显示给药后3 d、7 d BMSCs组神经功能评分较梗死对照组明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)。见图2。

图2 BMSCs组和梗死对照组各时间段mNSS评分

2．2 HE染色结果 大鼠脑切片行HE染色显示，梗死灶大部分位于大脑皮质和基底节。BMSCs组与梗死对照组梗死区可见较多神经细胞的缺失，同时伴格子细胞及中性白细胞。见图3。

图3 A：梗死对照组 B：BMSCs组HE染色，×200

2．3 VEGF表达 梗死对照组及BMSCs组缺血区可见阳性标记细胞(如箭头所示)，其中梗死对照组阳性细胞明显少于BMSCs组。见图4。BMSCs组在梗死3 d、7 d时的VEGF表达明显多于梗死对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。见图5。

图4 BMSCs治疗组MCAO大鼠VEGF的表达明显较梗死对照组增加 A：梗死对照组 B：BMSCs组VEGF免疫组织化学染色，×400

图5 BMSCs组VEGF表达较梗死对照组明显增加

3 讨论

脑梗死后局部脑动脉闭塞，脑组织灌流量降低，局部脑缺血、缺氧，脑组织功能的兴奋性降低，脑代谢率的下降，大脑皮质和皮质下神经细胞凋亡导致神经功能缺损。因此，改善脑代谢、增加脑血流量是治疗脑梗死后神经损伤的重要方法。研究已证实，及时恢复缺血区的血液供应，可减少脑细胞的损伤。同时实验室的研究结果提示，BMSCs移植对脑缺血动物模型具有明显的治疗效果。BMSCs移植能明显促进缺血区新生血管生成，减少梗死面积，促进神经功能的恢复，其主要是通过分泌多种营养因子，促进血管内皮细胞生成、血管形成等多种机制实现。同时，BMSC还能增强残留脑组织特别是缺血区周围的脑组织的功能和可塑性[5]。研究表明，提高脑组织的可塑性可促进卒中后神经功能的恢复[6]。血管发生的增多，可提高缺血半暗带区血液供应，从而挽救梗死周围区频死的神经细胞，促进神经功能的恢复。Zhang等[7-8]研究也显示，血管密度高的卒中患者比血管密度低的患者功能恢复快，同时存活时间也较长。新形成的血管可以提高缺血周围脑组织的血流灌注，改善微循环，从而促进神经功能的恢复。而VEGF具有促进内皮细胞增殖，诱导血管形成的特性[9]。在缺血缺氧状态下，VEGF 的表达可明显增加[10]。而VEGF可能是通过激活细胞上的磷脂酶C短暂地诱导Ca2+离子释放，从而促进内皮细胞的增殖进而促进新血管的形成[11-12]。因此，BMSCs可增加VEGF的表达，促进新生血管的形成，促进神经功能的恢复，为脑梗死的治疗和恢复提供可能。

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(收稿2016-08-21)

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1673-5110(2017)03-0052-03