酸性红壤中热研2号柱花草高效固氮根瘤菌的筛选

卢外强， 吴金山

(海南大学 热带农林学院, 海南 儋州 571737)

酸性红壤中热研2号柱花草高效固氮根瘤菌的筛选

卢外强， 吴金山*

(海南大学 热带农林学院, 海南 儋州 571737)

为筛选酸性红壤中适合热研2号柱花草的高效固氮根瘤菌菌株，在土培中将19个根瘤菌菌株分别接种到热研2号柱花草，通过株高、茎叶干重、茎叶氮含量、茎叶磷含量等指标确定酸性红壤中接种不同根瘤菌对柱花草的影响，并通过主成分分析确定酸性红壤中与热研2号柱花草搭配的高效根瘤菌菌株.结果表明：酸性红壤中与热研2号柱花草匹配的高效菌株为RJS9-1、BS2-2、 ZJ2-2、FS3-1-1、RJS9-2及BS1-1；接种后不利于柱花草生长的菌株为LY1、NN1-1-2及SM5-1.本实验结果为实际生产中通过接种氮高效根瘤菌提高柱花草产量提供了一定参考.

酸性红壤； 热研2号柱花草； 根瘤菌； 高效固氮； 筛选

柱花草Stylosanthesguianensis(Aublet) Swartz原产于美洲热带地区，是豆科(Fabaceae)柱花草属多年生草本植物，在世界热带和亚热带地区均有分布.自1962年引进入我国后，经试种筛选出热研2号柱花草(Stylosanthesguianensiscv. Reyan No.2)，于1991年通过全国草品种审定委员会审定[1]，热研2号柱花草具备众多很优点，如易种植、土壤条件要求不高，粗蛋白含量丰富和粗脂肪含量高、营养价值全面等[2]，作为优良的养殖草料，广泛应用于我国南方地区畜[3-4]、禽[5-6]、鱼[7-8]等农业养殖中.热研2号柱花草为多年生草本植物，其本身具有耐旱，喜高温高湿等特点.在水源充足时，枝叶生长速度快，并向四周扩散，而且根系发达，并附着生长大量的根瘤菌[9].其根瘤菌具有很强的固氮能力[10]，为植株的生长提供大量的氮肥，在生产中经常被作为纯天然的有机肥料[11]、也被用作植物间作[12]、改善土壤特质[13]，以防止大自然水土流失等用途[2].柱花草在我国的广东、海南、广西等省份等都有种植，但这些地区土壤多数为酸性，其土壤中含有大量限制植物与根瘤菌生长的物质，如大量的钙、锰、铝等元素都会对植物和根瘤菌的生长带来危害[14].根瘤形成的过程与土壤中的根瘤菌的作用密不可分，根瘤菌通过与豆科植物进行密切结合，产生一系列作用，最终形成了根瘤.而环境因素是影响根瘤菌与寄主共生固氮的重要因素.因此只有生命力强且具备良好固氮能力的豆科植物并且与当地土壤相适应，根瘤菌与其共生体建立的共生关系才能体现出它本身特有的功能和作用[15].李友国等[16]通过实验发现，根瘤菌的固氮效率高低与土壤中的根瘤菌特性以及植物体本身的遗传基因有重要关系，同时也受到其周围的环境条件多方面影响.陈文新等[15]通过实验研究最后提出过一个观点，在根瘤菌和植株共生关系中，只有找到对环境适应性能力最强的菌株，才能发挥出根瘤共生体的最大作用.本实验主要在沙培筛选出高效菌株的基础上，通过土壤栽培等方法进一步筛选适合于我国南方酸性红壤条件下热研2号柱花草的高效共生菌株，以期为根瘤菌菌剂的制备和热研2号柱花草的高产栽培提供理论依据.

1材料与方法

1.1材料

1.1.1供试品种及菌株 本研究选用的柱花草来源于中国热带农业科学院热带作物品种资源研究所牧草中心选育主推品种热研2号.供试菌株选择参考文献[17]，其来源如表1.

供试土壤来自于海南省儋州市中国热带农业科学院热带牧草研究中心基地，本基地以前从未种植过柱花草，而且基地土壤为砖红壤类型.在土壤采集过程，除去表面土壤3 cm，然后取30 cm厚的土层，并将土壤在容器中充分混匀，用50 mm筛孔过筛.

1.1.2供试土壤 通过实验测定，供试土壤主要成分基本情况如下：有效磷和有效氮的含量分别为8.29 mg·kg-1和45.75 mg·kg-1.pH值为5.04，偏酸性.全磷和全氮分别为0.42 g·kg-1，1.31 g·kg-1，有机质为9.98 g·kg-1.

1.2方法

1.2.1无菌种子的准备 将柱花草种子从种皮中取出，80℃水浴，5 min；95%乙醇(体积分数，下同)浸泡5 min后，2 g·L-1HgCl2浸泡3 min (已灭菌)；无菌水清洗5次，将种子放置于铺好发芽纸的培养皿里，于纸上喷洒50 μmol·L-1无菌CaSO4溶液，盖好培养皿；最后放置暗光处使其发芽.

1.2.2根瘤菌提取及菌液的处理 本实验采用酵母甘露糖琼脂(YMA)培养基作为基本培养基，固体、液体培养基制备好后于超净台中静置2 d，确定无细菌污染情况后，将各菌株接种至固体培养基上活化5 d后，将生长出的菌落接种于液体培养基中，28℃摇床培养(180 r·min-1)至对数期(OD600>0.9).

1.2.3土培系统的制备 用10 mL·L-1的盐酸将实验用花盆(9 cm×28 cm)浸泡过夜，ddH2O冲洗3次后浸泡30 min，晾干备用.将1.1.2中的土壤装入无菌花盆中(2.5 kg/盆).

1.2.4移苗、接种及管理 移植于土培系统中的柱花草幼苗，必须是无菌感染且需在对应菌液中浸泡15 min.移植(4株/盆)后在幼苗根部喷洒5 mL菌液，置于适宜环境中生长，每周补充1次低氮营养液.若土壤表面干燥，则补充浇灌无菌水，水量为田间持水量1/2.

1.2.5实验设计及方法 本实验选用双因子随机区组安排，分散为不同菌株处理(20份菌株和1个不接菌对照处理)和2个不同柱花草品种，该试验设4次重复，样本总数为2×21×4=168盆.

1.2.6取样及各指标水平的检测 栽植105 d后进行取样测定.土壤上部样品干燥后用作氮、磷含量的测定；将所取样品混匀捣碎，于H2SO4-H2O2溶液中消煮，全磷的测定使用钼锑抗比色法，全氮的测定使用自动定氮仪(Kjedahl 2300，FOSS，瑞士).对柱花草进行株高测定后取茎叶称量鲜重，装袋；于105℃烘箱中进行杀青20 min后，75℃烘干，称干重.

1.3数据处理

本实验中数据采用JMP9、Microsoft Excel 2000、SAS9.0等软件进行统计处理和方差分析，采用Tukey HSD作为显著性差异衡量标准，显著性水平P<0.01.通过IBM SPSS Statistics 19软件进行因子分析，以最大方差法进行方差正交旋转.

2结果与分析

2.1不同根瘤菌菌株对热研2号柱花草株高的影响

热研2号柱花草在酸性红壤中接种根瘤菌菌株后，不同菌株间株高差异极(F=9.34**，见表2).菌株BS2-3接种后的热研2号柱花草株高值最大，为42.73 cm，对照株的株高值最小.接种菌株CM2、PS2-1、PS5-1、DF4-2、RJS9-2、PN13-3、DH3-1、FS3-1-1、RJS9-1、BS1-1及ZJ2-2的柱花草株高也较高，且与接种菌株BS2-3的柱花草无显著差异.

2.2不同根瘤菌菌株对热研2号柱花草干重的影响

热研2号柱花草接种根瘤菌菌株后，植株失水后的质量在各菌株间差异也极为显著(F=4.72**，见表2).其中，干重值最大的为接种菌株BS2-3的柱花草植株(2.16 g)，干重值最小为不接种菌株的植株(0.59 g).除接种菌株SM5-1、PS5-1及LY1与不接种菌株茎叶干重差异不显著外，接种其他菌株的植株茎叶干重都较高，且与接种BS2-3的植株差异不显著.

2.3不同根瘤菌菌株对热研2号柱花草茎叶氮含量的影响

根瘤菌菌株接种热研2号柱花草后，茎叶含氮量在菌株间差别达到显著水平(F=3.21*，见表2).接种菌株BS2-3茎叶含氮量最高，为23.19 mg·g-1；不接种菌株的植株含氮量最低，为6.64 mg·g-1；除接种菌株DH3-1与不接种菌株茎叶干重含氮量差异不显著外，其他接种菌株茎叶鲜重含氮量都较高，与接种BS2-3差异不显著.

2.4不同根瘤菌菌株对热研2号柱花草茎叶磷含量的影响

20株根瘤菌菌株接种热研2号柱花草以后，经过测定茎、叶的含磷量在菌株间差别达到显著水平(F=3.40*，见表2).接种菌株PS2-1后的植株茎叶含磷量最高(5.20 mg·g-1).不接种菌株的植株含磷量最低(1.95 mg·g-1)，显著低于BS2-3、ZJ2-2、FS3-1-1 及PN13-3的磷含量.

注：字母表示菌株间多重比较显著性分析结果，纵向数值后字母不同表示差异极显著(P<0.01).**表示差异极显著.

2.5酸性红壤中热研2号柱花草高效菌株的确定

通过对柱花草株高、茎叶鲜重、茎叶干重、含磷量及含氮量等指标进行主因子分析，株高、磷含量两因子的加和贡献率已到了89.71%，因此只需提炼2个公因子即可(见表3).属于第1主导因子的茎叶鲜重、茎叶干重、及株高正载荷高，因此，第1因子F1中基本代表了产量性状.在对各变量的的方差贡献中，第1公因子F1的贡献率达到了45.83%，而第2公因子F2较高的正载荷来源于磷含量和含氮量.第2公因子决定了柱花草的质量特性.在对各变量方差的贡献率中，F2占43.88%(89.71%-F1,见表3).

根据各个观测值在第1和第2主因子上的标准得分，绘制关于F1和F2的二维平面图(图1).热研2号柱花草在酸性红壤中接种根瘤菌RJS9-1、BS2-2、 BS1-1、FS3-1-1、RJS9-2及ZJ2-2菌株后，植株的F1和F2全为正值，说明柱花草与上述菌株的共生有利于其在酸性红壤中的生长.接种菌株LY1、NN1-1-2及SM5-1与对照一样在F1和F2上均为负值，表明上述菌株的共生不能有效地提高热研2号柱花草在酸性红壤中的质量与产量.

注：表中数据是将热研2号柱花草接种不同根瘤菌后各指标，方差正交旋转后所得的前2个主因子载荷矩阵及所解释的样本总方差的累计比例.

3讨论

陈文新[15]院士在长期针对根瘤菌与豆科植物共生关系的研究过程中，对有关方面有了新论点，即发现不同地区地理环境中的相同植物可与不同根瘤菌形成共生关系并固氮；不同植物在相同地区地理环境条件下可以与相同的根瘤菌形成共生关系并固氮.因此，对根瘤菌筛选时，必须既要着重于种植植物的品种(并非是种)，又要着重于生态环境，依据两方面因素将根瘤菌与宿主匹配到最佳，以期两者的共生达到最佳.前期实验中接种结果不稳定可能是由于仅考虑了与宿主的关系.

柱花草的产量和品质最能体现其生长状况是否良好，柱花草高产则含氮量也高.在筛选评定高效菌株时，主要用产量和含氮量来进行说明.当在高效筛选常规菌株时，常用于比较有效性的指标有如下几个：结瘤与否、结瘤的数目和根瘤的重量是多少、根瘤固氮酶活力的强弱、植株地上部的干重，植株全氮量、固氮率及根瘤菌的宿主范围等等.由于柱花草根瘤的地下部分分布范围广、数目多，而且体积细小，所以无法准确测定根瘤的有效性，因此也很难统计根瘤以及有效根瘤数目.曾昭海[18]认为在土壤环境条件不同时，应该有针对性地筛选高效的指标.师尚礼[19]认为应通过全局把握菌株性能、寄主植物、环境条件，选出适应特殊寄主和环境条件的特殊菌株或适应多寄主和复杂环境条件的广谱菌株.而筛选出的菌株应满足以下条件：固氮效率高，能与宿主迅速组成有效根瘤，并在不同的田间条件下能迅速适应并有效结瘤，与土壤中原生根瘤菌的竞争力较强，在无宿主时存活能力也较强，在载体基质中也能生长，在种子上存活率也较高，对酸碱、化肥、农药有较高耐受力，有一定的遗传稳定性.本文引入了酸性土壤介质，筛选了酸性条件下适合热研2号柱花草的高效固氮根瘤菌，对于实际生产有着重要的参考价值.

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Selection of highly efficient Rhizobia forStylosanthes
guianensiscv. Reyan No.2 in acid red soil

LU Waiqiang， WU Jinshan

(College of Tropical Agriculture and Forestry， Hainan University， Danzhou， Hainan 571737)

In order to select high efficient Rhizobia strains forStylosanthesguianensiscv. Reyan No.2 (shorted as Reyan 2) in the acid red soil， 19 Rhizobia strains were inoculated into the roots of Reyan 2. Impact of different Rhizobia strains on Reyan 2 in acid red soil were determined by indexes such as height and dry weight， nitrogen content and phosphorus content of stem and leaf. Then highly efficient strains were identified through principal component analysis. The results showed that highly efficient strains forStylosanthesguianensiscv. Reyan No.2 in acid red soil are RJS9-1， BS2-2， ZJ2-2， RJS9-2 and FS3-1-1， while the strains not beneficial to plant growth are LY1， NN1-1-2 and SM5-1. These results provided reference in improvingStylosanthesguianensisproduction by inoculating highly efficient Rhizobia in practice．

acid red soil； Reyan No.2； Rhizobia； nitrogen fixation； selection

2016-12-22.

海南省自然科学基金项目(314057)．

1000-1190(2017)02-0203-05

Q945.79

A

*通讯联系人. E-mail: wujsh2007@163.com.