3类洗涤法处理不同质量精液标本的效果比较及在IUI中的应用选择

饶金鹏　邱枫　蔡益婷

【摘要】 目的：通過比较密度梯度离心法（density-gradient centrifugation，DGC）、上游法（swim-up，SU）和简单洗涤法（simple washing， SW）处理不同质量精液标本的效果，优选出最合适的宫腔内人工授精（Intrauterine insemination，IUI）精液洗涤方法。方法：选取男科实验室行精液常规检查的患者中收集精液量≥3 mL的精液标本90份，其中精子浓度<15×106/mL的少精症患者精液标本23份，浓度与活力正常（浓度≥15×106/mL，PR≥32%且PR+NP≥40%）的精液标本67份，每份精液标本各取3个1 mL分别用密度梯度离心法、上游法和简单洗涤法处理。通过不同方法的洗涤处理，比较各组精子洗涤前后的浓度、活力（PR）及回收率。结果：3种处理方法洗涤后的PR较洗涤前均有显著提高（P<0.05）；在处理后的精子浓度方面，简单洗涤法处理要显著高于其余两类方法（P<0.05）；在处理后的PR和活率（PR+NP）方面，密度梯度离心法和上游法又要高于简单洗涤法（P<0.05）；在回收率方面，密度梯度离心法和简单洗涤法则显著高于上游法组（P<0.05）。结论：在处理少精症患者精液标本时，上游法因其较低的回收率不适宜被采用；当精子浓度<15×106/mL且精子总数小于正常值（39×106个）时，为保证处理后最终前向精子总数>10×106个，精子标本不适合过多次数的洗涤处理，宜采用简单洗涤法；而只有当精液体积较大时，在保证IUI精子终浓度的同时，密度梯度离心法较简单洗涤法能更好地去除白细胞和不成熟生殖细胞等杂质，而更适宜被采用；在处理浓度活力正常精液标本时，密度梯度离心法和上游法较之简单洗涤法能获得更高的精子活力（P<0.05）而更适宜被采用；同时，密度梯度离心法因较之上游法具有更高的回收率（P<0.05），且具备操作易标准化和操作时间短等特点而更具实用价值。

【关键词】 密度梯度离心法； 上游法； 简单洗涤法； 少精症； IUI

【Abstract】 Objective：To select the most appropriate IUI sperm washing methods through comparative analysis of density-gradient centrifugation，swim-up and simple washing processing different quality of semen specimen.Method：90 semen specimens （semen volume≥3 mL）from laboratory of andrology were obtained.Among them，23 semen specimens were obtained from oligospermatism patients（sperm concentration<15×106/mL），the other 67 semen specimens were obtained from normal men（sperm concentration≥15×106/mL，PR≥32%，PR+NP≥40%）.Each semen sample were taken with 1 mL for processing by density gradient centrifugation，swim-up and simple washing methods respectively.80% and 40% pure ception were used in density-gradient centrifugation.Sperm concentration，motility and recovery rate were compared before and after treatment by the three methods.Result：Sperm motility（PR） increased obviously after treated by all the three methods（P<0.05）.Sperm concentration after treated by simple washing was significantly higher than other two methods（P<0.05）.PR after treated by density-gradient centrifugation and swim-up were significantly higher than simple washing（P<0.05）.Sperm recovery rate after treated by density-gradient centrifugation and simple washing were significantly higher than swim-up（P<0.05）.Conclusion：Swim-up is not suitable for oligospermatism patients for its low sperm recovery rate.When sperm concentration<15×106/mL and total semen count<39×106，we choose simple washing to ensure that final sperm count>10×106 and avoid frequently washing.When semen volume is large enough，for density-gradient centrifugation can reduce leukocyte and immaturity cell better than simple washing，it is more appropriate be selected.When PR and concentration are normal，density-gradient centrifugation and swim-up are both better than simple washing.However，for sperm recovery rate of density-gradient centrifugation is higher than swim-up，and it is easier be standardized and cost less time for operation，the density-gradient centrifugation is the more appropriate method for IUI.

【Key words】 Density-gradient centrifugation； Swim-up； Simple washing； Oligospermatism； IUI

First-authors address：The Second Affiliated Hospital of Zhejiang University School of Medicine，Hangzhou 310052，China

doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.01.017

宫腔内人工授精（Intrauterine insemination，IUI）因具有低侵入性、操作简单、并发症少、费用低等特点而成为诸多辅助生殖技术（Assisted reproductive technology，ART）中最为常用的助孕方式之一，但一直以来，其成功率始终不高[1-6]。影响IUI成功率的因素很多，如男方精液参数、女方年龄、IUI授精时间选择等，但其中精子体外优选因可达到去除精液中的精浆、细胞碎片、病原微生物等有害物质的目的而成为影响结局的最为重要环节之一。常用的精液体外处理方法有密度梯度离心法、上游法和简单洗涤法，3类方法各有利弊，其能达到的洗涤效果和ART妊娠结局报道也不尽相同[7-10]。本研究根据精液标本的质量将其分为少精组（精子浓度<15×106/mL）和正常组，分别用3类方法对其进行处理，通过比较来决定特定条件下采取何种方法行IUI最为适宜。

1 材料与方法

1.1 标本来源及分组 本研究中精液标本均来自2014年12月-2016年6月在本院生殖医学中心及泌尿外科就诊，选取男科实验室行精液常规检查的患者中收集精液量≥3 mL的精液标本90份，其中精子浓度<15×106/mL精液标本23份为少精组，浓度与活力正常（浓度≥15×106/mL，PR≥32%且PR+NP≥40%）的精液标本67份为正常组。

1.2 实验仪器和试剂 标准垂直净化工作站（苏州智净SW-CJ-1FD），恒温培养箱（美国THERMO 3111），高速离心机（美国THERMO SL16R），相差显微镜（日本OLYMPUS CX31），Markler计数板（以色列SELF-MEDICAL），彩色精子质量检测系统（北京伟力WLJY-9000），精子洗涤液（美国SIGMA EBSS，Lot：RNBD2487），精子密度梯度液（美国SAGE Pure Ception 40%，80%，Lot：16100229）。

1.3 精液处理方法

1.3.1 密度梯度离心法 将1 mL 80%的密度梯度液加入离心管底部，轻柔得将1 mL 40%的密度梯度液加在液面上，再将1 mL液化混匀的精液小心加在40%的密度梯度液液面上，离心600 r/min×

20 min后弃上清，加入5 mL洗涤液吹打混匀后离心200 r/min×5 min，洗涤步骤再重复一遍后将精子沉淀重悬于0.5 mL培养液中。

1.3.2 上游法 将液化混匀的1 mL精液置于试管底部，轻柔得在液面上方加入1.2 mL洗涤液，将试管倾斜45°，置37 ℃培养箱孵育60 min，轻轻将试管恢复直立后，将最上层1 mL液体转移到另一支试管，再加入2 mL洗涤液吹打混匀，离心200 r/min×10 min，弃上清后将精子沉淀重悬于0.5 mL培养液中。

1.3.3 简单洗涤法 将液化混匀的1 mL精液加入试管并与1 mL洗涤液充分混匀，离心200 r/min×10 min，小心吸出上清液后将沉淀重悬于1 mL培养液再次离心200 r/min×10 min，弃上清，将精子沉淀重悬于

0.5 mL培养液中。

1.4 精液分析方法 处理前液化完全的精子原液及3种方法处理后充分混匀且于37 ℃培养箱放置30 min的精子悬液各取10 μL，置于Markler计数板中央，盖上盖板，将显微镜总放大倍数调至200倍，借助CASA精子质量检测系统计算精子浓度和活力。再根据公式：精子回收率=洗涤后活动精子总数/洗涤前活动精子总数×100%=（洗涤后精液体积×洗涤后精子浓度×洗涤后精子活动率）/（洗涤前精液体积×洗涤前精子浓度×洗涤前精子活动率）×100%计算出最终的回收率。

1.5 统计学处理 使用SPSS 17.0统计软件进行分析，计量资料采用（x±s）表示，比较采用t检验或方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

不論是精子浓度<15×106/mL的少精症精液标本，还是浓度与活力正常的精液标本，用3种处理方法洗涤后，精子的活力（PR）和活率（PR+NP）都得到了显著的提高（P<0.05）；在浓度方面，简单洗涤法要显著高于其余两类方法（P<0.05）；在处理后的PR和PR+NP方面，密度梯度离心法和上游法又要高于简单洗涤法（P<0.05）；在回收率方面，密度梯度离心法和简单洗涤法则显著高于上游法（P<0.05）。见表1。

3 讨论

精子体外分离技术的目的是获得尽可能多的活动精子，且尽可能去除死精、白细胞和细菌等杂质，去除有毒或活性氧类物质（reactive oxygen species，ROS），同时具备操作易标准化和快速等特点[11-13]。但当前，很难找到一项技术能同时满足上述所有要求，因此，为达到最佳的处理效果，应根据精液质量的不同选择最合适的处理方法。本研究根据精子质量的不同，将精液标本分为少精组（精子浓度<15×106/mL）和浓度活力正常组，并分别用密度梯度离心法、上游法和简单洗涤法对其进行处理。结果显示，不论是少精组还是正常组标本，在精子的回收率上，上游法处理组只有30%左右，远低于其余两种处理方法的70%，这一结论与先前的研究一致[3，8，14]。根据WHO人类精液实验操作手册第5版的要求，进行IUI洗涤后前向运动精子总数不少于10×106个，而本实验中上游法处理

1 mL少精症精子的前向运动精子总数只有（1～1.5）×106，远不能达到要求，故不适宜选用。而当精子浓度<15×106/mL且精子总数小于正常值（39×106个）时，采用密度梯度离心法也很难使最终精子总数达到标准，故宜采用简单洗涤法进行处理，只有当精液体积足够大时，密度梯度离心法较之简单洗涤法能更好地去除白细胞和不成熟生殖细胞等杂质，而更适宜被采用。在处理浓度活力正常精液标本时，密度梯度离心法和上游法的处理后精子活力（PR）及活率（PR+NP）均要显著高于简单洗涤法，且简单洗涤法不能充分洗脱精液中的白细胞、细菌和死精子等杂质，产生的氧自由基会对精卵的结合造成不利的影响[15-18]，因此，在处理正常精液标本时选用前两种方法较为合适。但密度梯度离心法和上游法之间比较，何种更适用于宫腔内人工授精至今尚无定论。李涛等[19]对无明显临床异质性的各研究用随机效应模型进行Meta分析，发现上游法与梯度离心法相比，在周期妊娠率、流产率、精子密度、精子活力4项测量指标上差异均无统计学意义（P>0.05）。汪存利等[20]通过比较2种方法发现，在处理浓度与活力正常精液标本时，上游法处理后的精子浓度显著低于密度梯度离心法，但活力却要显著高于后者。但邓俊耀等[14]通过对比发现2种方法在洗涤后精子活力方面比较差异无统计学意义（P>0.05），而密度梯度离心法在洗涤后精子密度及回收率上都要明显高于上游法组。本研究显示，密度梯度离心法和上游法处理浓度活力正常的精液标本都能获得较好的精子活力（80%～90%）。但上游法主要依赖于活动精子在培养液中的运动能力，而一部分有潜在运动能力的精子可能被由多层细胞组成的细胞团包裹而难以到达与培养基接触的界面，且细胞团内精子与细胞碎片或白细胞接触易产生高水平ROS而降低精子功能[11]，这些因素都导致在精子回收率方面上游法要低于密度梯度离心法，加之后者具备操作易标准化和操作时间短等特点，因此，笔者认为在此情况下，密度梯度离心法更具实用价值。

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（收稿日期：2016-09-02） （本文编辑：周亚杰）