他克莫司对大鼠肝脏蛋白磷酸酶2A表达的影响

王得恩，陈充抒2，王宏宇，马永华，徐 春

他克莫司对大鼠肝脏蛋白磷酸酶2A表达的影响

王得恩1，陈充抒2，王宏宇1，马永华1，徐 春1

目的 通过建立他克莫司（FK-506）诱导的糖尿病大鼠模型，探讨FK-506对大鼠肝脏蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A, PP2A）表达的影响。方法 将40只雄性SD大鼠（体重80～100 g/只）随机分成FK-506组和对照组，每组20只。FK-506组给予FK-506灌胃，剂量为4 mg/（kg·d）；对照组给予等量饮用水。每月测量大鼠的空腹血糖及FK-506血药浓度，连续测量5个月。5个月后空腹状态下乙醚麻醉处死大鼠，心尖穿刺取血测量大鼠空腹血清胰岛素水平，并计算稳态模式评估胰岛素抵抗指数（homeostasis model assessment-insulin resistance index，HOMA-IR）和胰岛素敏感指数（insulin secretion index，ISI），用免疫组化方法检测大鼠肝脏组织中PP2A的表达。使用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。结果 给药3个月后FK-506组血糖平均浓度为（8.07±0.84） mmol/L，有80%（16/20）的大鼠血糖浓度大于7 mmol/L，高于对照组的（5.27±0.38）mmol/L；5个月后 FK-506组所有大鼠血糖浓度大于7 mmol/L。FK-506组大鼠的HOMA-IR高于对照组（t=47.80, P＜0.05），ISI低于对照组（t=37.70, P＜0.05）。FK-506组的PP2A在肝组织细胞浆内的表达水平高于对照组（χ2=19.80, P＜0.05）。结论 FK-506可成功诱导大鼠糖尿病模型。在FK-506诱导的糖尿病大鼠肝脏中，PP2A 表达明显增高,这可能是FK-506升糖的作用机制之一。

他克莫司；器官移植后糖尿病；蛋白磷酸酶2A；大鼠；胰岛素抵抗

器官移植术是终末期疾病比较有效的治疗方法，随着外科学、异体配型技术、免疫抑制药的发展，器官移植受者长期存活得以实现，移植后糖尿病（post transplantation diabetes mellitus，PTDM）是器官移植后的并发症之一，其发病率逐年增加。移植后免疫抑制药为PTDM的危险因素之一，临床研究发现，糖皮质激素和钙调磷酸酶抑制药可以引起血糖的升高[1,2]，他克莫司（FK-506）是一种钙调磷酸酶抑制药，其升血糖作用机制尚不清楚。

蛋白磷酸酶2A（protein phosphatase 2A, PP2A）是一类Ser/Thr蛋白磷酸酶抑制药，通过去磷酸化作用使已经磷酸化的激酶脱磷酸化，影响多种信号通路的传导。本研究模拟移植术后患者正常用药途径及用药量，使用移植术后患者最常用的免疫抑制药物FK-506作为诱导剂，建立大鼠的糖尿病模型，用免疫组化方法观察FK-506组与对照组大鼠肝脏PP2A的表达水平，探讨PP2A在FK-506诱导型糖尿病中的作用。

1 材料与方法

1.1 动物材料 无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级的雄性SD大鼠40只，个体健康、鼠龄相仿，体重为80～100 g/只，出生后未做特殊处置，自然实验室环境生长，购自中国军事科学院医学中心实验室[实验动物许可证号：SCXK（京） 2005-0006]。

1.2 试剂材料 FK-506胶囊：规格为1 mg/粒，安斯泰来制药有限公司；放免胰岛素检测试剂盒：上海生物制品研究所；二步法EnVisionTM试剂盒：Dako生物公司（批号：K400511）；PP2A 试剂：CST公司（批号：2038）。

1.3 分组及给药 将40只大鼠随机分为两组：FK-506组和对照组，每组20只，两组的平均体重依次为（89.65±4.91）g、（89.60±4.50）g，体重组间差异无统计学意义（t=0.34, P=0.97），有可比性。

FK-506组给药剂量为4 mg/（kg·d），对照组给予等量日常饮用水，两组大鼠均在禁食禁水8 h后，经胃管灌胃给药，1 h后喂食。每月测空腹血糖和FK-506浓度，5个月后乙醚麻醉处死大鼠，心尖取血分离出血浆于－70℃冰箱（Thermo公司）中保存，大鼠肝脏和胰腺组织放于4%多聚甲醛中保存。

1.4 放免法测定大鼠血清胰岛素水平 稳态模式评估（homeostasis model assessment，HOMA）指数计算方法：计算胰岛素敏感指数（insulin secretion index, ISI）和HOMA胰岛素抵抗指数（ HOMA insulin resistance index, HOMA-IR）。计算公式：ISI=1/空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）×空 腹 胰 岛 素（fasting serum lisulin，FINS）；HOMA－IR=FBG×FINS/22.5。

1.5 化学发光法测定血浆中FK-506的浓度 FK-506组大鼠尾静脉取血，以3000 r/min离心15 min得到血清标本，与特异抗体混合，加入标记的FK-506作为酶竞争物，并与微珠上的FK-506药物抗体进行结合，接种采用磁场促使微珠分离，清洗后再将预激法和激发剂产生化学发光反应，最后根据标准曲线得出FK-506的浓度。

1.6 免疫组化方法分析肝脏组织中PP2A蛋白的表达

免疫组化结果分析：（1）将每一视野下阳性细胞按照百分比（%）分为5级。0分为无阳性细胞；1分为阳性±s描述，计数资料采用频数与率描述。（1）两组大鼠的体重、血糖水平、ISI和HOMA-IR的比较采用两组独立样本t检验，6个时间点两组血糖比较的检验水准调整为0.05/6，以P＜0.008为差异有统计学意义；（2）两组大鼠PP2A表达强度比较采用χ2检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 FK-506血药浓度的测定 每月末对FK-506组大鼠尾静脉取血，监测每个月血药浓度：第1个月（7.71±0.30） ng/ml，第2个月（8.40±0.48）ng/ml，第3个月（8.87±0.26）ng/ml，第4个月（8.91±0.18）ng/ml，第5个月（9.07±0.24）ng/ml。FK-506组大鼠平均5个月FK-506血药浓度维持在（8.59±0.59）ng/mL，与人体抗排异治疗所要求的血药浓度一致。

2.2 血糖水平的测定 空腹（禁食禁水8 h以上）大鼠尾静脉取血，测定大鼠的血糖水平。实验前两组平均血糖水平无差异（t=0.56, P=0.58）。第3个月，FK-506组大鼠血糖平均浓度为（8.07±0.84）mmol/L ，且有80%（16/20）大鼠血糖浓度＞7.0 mmol/L；第5个月，FK-506组所有大鼠血糖浓度＞7.0 mmol/L，糖尿病模型诱导成功。同期，对照组所有大鼠的血糖浓度＜7.0 mmol/L。用药前及用药后两组血糖情况见表1。

2.3 HOMA-IR及ISI 用药5个月后，FK-506组大鼠的HOMA-IR高于对照组[（4.82±0.10） vs （3.24±0.11），t=47.80，P＜0.05]，ISI低于对照组[（0.092±0.002） vs（0.137±0.005），t=37.70，P＜0.05]。

2.4 大鼠肝脏PP2A 表达水平 用药5个月后，对大鼠肝脏标本行免疫组化染色。显微镜下与对照组大鼠比较，FK506组大鼠肝脏细胞被着为棕褐色（图1、图2）。测定PP2A的表达水平，FK-506组大鼠肝脏标本中PP2A阳性率为80%（16/20），对照组PP2A阳性率为10%（2/20），组间差异有统计学意义（χ2=19.80，P＜0.05）。细胞≤10%； 2分为阳性细胞11%～50%； 3分为阳性细胞51%～75%；4分为阳性细胞＞75%。（2）将每个细胞的着色强度分为4级：0分为无色，1分为淡黄色，2分为棕黄色，3分为棕褐色。（3）标本的阳性细胞百分比积分×颜色的强度积分＞3分可确定为阳性。

1.7 大鼠糖尿病模型建立标准 大鼠尾部静脉取血，监测尾静脉平均血糖水平＞7.0 mmol/L。

1.8 统计学处理 使用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资料采用x

表1 两组大鼠用药期间每个月末血糖水平的比较

图1 对照组肝脏组织PP2A的表达（免疫组化染色×100）

图2 FK-506组肝脏组织PP2A的表达（免疫组化染色×100）

3 讨 论

FK-506作为第二代神经钙蛋白抑制药（calcineurin inhibitor, CNI）的代表性药物，属于大环内酯类抗生素,通过作用于T细胞而发挥免疫抑制作用。由于FK-506比其他CNI类药物免疫抑制效用更强且更安全，被广泛应用于器官移植领域及非移植领域，逐渐成为最常用的免疫抑制药物。长期使用FK-506可引起糖代谢紊乱，甚至引起PTDM。实验证实FK-506可以对胰岛β细胞产生直接损害作用[3]。FK-506处理过的胰岛β细胞及动物模型胰岛β细胞的细胞核、细胞浆等都发生改变，甚至出现胰岛β细胞凋亡。本研究将FK-506组的大鼠血液药物浓度控制在6～10 μg/L之间，这是目前临床维持免疫抑制作用最有效药物浓度，同时研究者观察到FK-506大鼠空腹血糖水平上升，HOMA-IR上升，而ISI下降，最终完成了FK-506诱导的糖尿病模型的建立。动物实验证实，FK-506诱导的糖尿病模型中：空腹血糖升高，空腹胰岛素水平升高，C-肽浓度上升，ISI下降、HOMA-IR上升，确定PTDM患者存在IR[3-5]。导致机体发生IR的原因主要有肥胖、炎性反应、氧化应激、线粒体功能障碍、微量元素缺乏、丙型肝炎等。有研究认为，在上述各种原因导致的IR中均存在PP2A的作用，在高脂饮食喂养的大鼠IR模型中，内脏脂肪细胞内PP2A的表达明显增加，该研究认为PP2A表达增加，导致信号通路磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶（phosphatidylinositol 3 kinase-serine/threonine kinase，PI3K-Akt）途径被抑制，其中具体表现为Akt蛋白激酶磷酸化水平下降使大鼠磷酸化-丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（phospho-protein serine threonine kinase，P-Akt）减少，引起IR[6-9]。PP2A家族的主要成员参与了炎性因子对胰岛素受体底物-1（insulin receptor substrate-1，IRS-1）的Ser307磷酸化位点的影响,降低了Akt的磷酸化水平，抑制了胰岛素信号通路[7]。Yan等[8]证明了转录因子FOXO1（forkhead box protein O1）活化核内转运的关键调节因子是PP2A，氧化应激时胰岛β细胞中的PP2A与FOXO1的核内趋向激活相关，在2型糖尿病小鼠模型中也发现，血糖增高的同时，胰岛β细胞中的PP2A和细胞核的FOXO1水平都有所升高。而FOXO1活化和核内聚集是氧化应激发生IR的关键。Galbo等[9]认为，游离脂肪酸可增加PP2A的活性，而选择性改变胰岛素在肝脏葡萄糖代谢中的活性，线粒体功能障碍引起内脏组织中游离脂肪酸增多。因此，可推测线粒体功能异常引起PP2A活性增加使P-Akt下降，葡萄糖合成激酶（glycogen synthase kinase-3 α，Gsk-3α）激活抑制糖原合成酶并促使糖的异生。研究人员发现，丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）促进PP2A表达，抑制胰岛素信号的传导，作为HCV诱发糖尿病的机制之一[10-12]。综上所述，PP2A活性增加是导致IR的重要环节。本研究由FK-506诱导糖尿病模型，并选取糖代谢的主要器官肝脏作为研究对象，分析了PP2A在肝脏组织中的表达，结果显示，糖尿病大鼠的肝脏中PP2A的表达明显高于对照组，提示PP2A在FK-506引起胰岛素抵抗中发挥一定的作用。

IR发生在胰岛素与胰岛素受体结合以后的信号传导过程，胰岛素信号传导途径主要有两条：一条是通过PI3K-Akt途径，另一条是通过蛋白活化丝裂原激活蛋白酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）途径。PI3K-/Akt途径在IR中占据重要的位置，而MAPK信号传导途径在IR发生中并非主要作用，实验证实，抑制MAPK通路后，葡萄糖的利用和糖原合成均未受到明显影响，而PP2A参与胰岛素信号通路中多个信号分子的去磷酸化[13-15]。本研究发现FK-506导致大鼠肝脏组织PP2A的表达增加，这可能是FK-506升糖机制之一。

FK-506可诱导大鼠发生糖尿病，在FK-506诱导的糖尿病大鼠的肝脏中，PP2A 表达明显增高。FK-506通过增加PP2A的表达水平，干扰胰岛素信号传导通路，可能是FK-506引起胰岛素抵抗的机制之一。

[1]Sulanc E, Lane J T, Puumala S E, et al. New-onset diabetes mellitus after kidney transplantation: an application of 2003 international guidelines [J]. Transplantation, 2005, 80（7）: 945-952. DOI: 10.1097/01. TP.0000176482.63122.03.

[2]Kurzawski M, Dziewanowski K, Kêdzierska K, et al. Association of transcription factor 7-like 2（TCF7L2）gene polymorphism with posttransplant diabetes mellitus in kidney transplant patients medicated with tacrolimus [J]. Pharmacological Reports, 2011, 63（3）: 826-833. DOI: 10.1016/S1734-1140（11）70595-3.

[3]滕雅芹, 牛玉坚, 徐 春, 等. 他克莫司对大鼠血糖的影响及其机制的探讨[J]. 中国实验动物学报, 2012, 20（2）: 74-77. DOI: 10.3969/j.issn.1005-4847.2012.02.015.

[4]Zelle D M, Corpeleijn E, Deinum J, et al. Pancreatic betacell dysfunction and risk of new-onset diabetes after kidney transplantation [J]. Diabetes Care, 2013, 36（7）: 1011-1021. DOI: 10.2337/dc12-1894.

[5]Goodyer W R, Gu X, Liu Y, et al. Neonatal betacell development in mince and human is regulated by calcaineurin/NFAT [J]. Dev Cell, 2012, 23（1）: 21-34. DOI: 10.1016/j.devcel.2012.05.014.

[6]Jun H S, Hwang K, Kim Y, et al. High-fat diet alters PP2A, TC10, and CIP4 expression in visceral adipose tissue of rats [J]. Obesity, 2008, 16（6）: 1226-1231. DOI: 10.1038/ oby.2008.220.

[7]Cohen P T, Philp A, Vázquez-Martin C. Protein phosphatase 4-from obscurity to vital functions [J]. FEBS Lett, 2005, 579（15）: 3278-3286. DOI: 10.1016/ j.febslet.2005.04.070.

[8]Yan L, Guo S, Brault M, et al. The B55α-containing PP2A holoenzyme dephosphor- ylates FOXO1 in islet β-cells under oxidative stress [J]. J Biochem, 2012, 444（2）: 239-247. DOI: 10.1042/BJ20111606.

[9]Galbo T, Olsen G S, Quistorff B, et al. Free fatty acidinduced PP2A hyperactivity selectively impairs hepatic insulin action on glucose metabolism [J]. PLoS One, 2011, 6（11）: e27424. DOI: 10.1371/journal.pone.0027424.

[10]Negro F. Mechanisms of hepatitis C virus-related insulin resistance [J]. Clin Res Hepatol Gastroenterol, 2011, 35（5）: 358-363. DOI: 10.1016/j.clinre.2011.01.011.

[11]Bernsmeier C, Duong F H, Christen V, et al. Virus-induced overexpression of protein phosphatase 2A inhibits insulin signaling in chronic hepatitis C [J]. J Hepatol, 2008, 49（3）: 429-440. DOI: 10.1016/j.jhep.2008.04.007.

[12]Bose S K, Shrivastava S, Meyer K, et al. Hepatitis C virus activates the mTOR/S6K1 signaling pathway in inhibiting IRS-1 function for insulin resistance [J]. J Virol, 2012, 86（11）: 6315-6322. DOI: 10.1128/JVI.00050-12.

[13]Kinney B P, Qiao L, Levaugh J M, et al. B56 alpha/protein phosphatase 2A inhibits adipose lipolysis in high-fat dietinduced obese mice [J]. Endocrinology, 2010, 151（8）: 3624-3632. DOI: 10.1210/en.2010-0245.

[14]O'Neill H M, Holloway G P, Steinberg G R. AMPK regulation of fatty acid metabolism and mitochondrial biogenesis: Implications for obesity [J]. Mol Cell Endocrinol, 2013, 366（2）:135-151. DOI: 10.1016/ j.mce.2012.06.019.

[15]Mistafa O, Aram G, Sandeep K, et al. Purinergic receptormediated rapid depletion of nuclear phosphorylated Akt depends on pleckstrin homology domain leucine-rich repeat phosphatase, calcineurin, protein phosphatase 2A, and PTEN phosphatases [J]. J Biol Chem，2010, 285（36）: 27900-27910. DOI: 10.1074/jbc.M110.117093.

（2016-09-14收稿 2016-12-14修回）

（本文编辑 罗发菊）

Effect of tacrolimus in the expression of protein p-hosphatase 2A in liver tissue

WANG De'en1, CHEN Chongshu2, WANG Hongyu1, MA Yonghua1, and XU Chun1. 1. Department of Endocrinology, 2. Department of Pharmacology, General Hospital of Chinese People's Armed Police Force, Beijing 100039, China

XU Chun, E-mail: wjxuchun@soho.com

Objective This study aimed to establish whether tacrolimus (FK-506) induced diabetes in rats, and analyze the effect of FK-506 on the expression of protein phosphatase 2A (PP2A) in liver tissue of the rats. Methods 40 male SD rats (80-100 g) were randomly divided into FK-506 group and control group. The rats in FK-506 group were administrated with tacrolimus 4 mg/kg daily. The rats in control group were given the same amount of normal drinking water daily. Rat body weights, fasting blood glucose concentration and blood concentration of tacrolimus were measured monthly. After 5 months all rats were euthanized by ether anesthesia. Fasting serum insulin levels of the rats were determined by puncture of cardiac apex, and then homeostasis model assessment-insulin resistance index (HOMA-IR) and insulin secretion index (ISI) were calculated. The expressions of PP2A in liver tissue of the rats were determined by immunohistochemical method. Software of SPSS 17.0 was used for statistical analysis. Results Three months after feeding of FK-506, the average concentration of blood glucose in FK-506 group was (8.07±0.84) mmol/L, in which blood glucose concentrations of 80% of the rats was greater than 7 mmol/L, and were higher as compared with control group (5.27±0.38) mmol/L; blood glucose concentration of all the rats in group FK-506 were greater than 7 mmol/L five months after feeding of FK-506. The HOMA-IR in FK-506 group was significantly higher than in control group (t=47.80, P＜0.05) and ISI was significantly lower than the control group (t=37.70, P＜0.05). The expression of PP2A in liver tissue in FK-506 group was higher than in control group (χ2=19.80, P＜0.05). Conclusions FK-506 can induce diabetes in rats. The expressions of PP2A in liver tissues of diabetic rats induced by FK-506 were increased, which may be due to the hyperglycemic effects of tacrolimus.

tacrolimus; post-transplantation diabetes mellitus; protein phosphatase2A; rat; insulin resistance

R587.1

10.13919/j.issn.2095-6274.2017.02.006

武警总医院科研项目（WZ20130303）

100039 北京，武警总医院：1.内分泌科, 2. 药剂科

徐 春，E-mail：wjxuchun@soho.com