宫颈癌组织中miR-21和Stat3的表达及相关性研究

杨朝晖 章辉 顾华敏 范广民 曹学全 王四玲 卢洪胜

宫颈癌组织中miR-21和Stat3的表达及相关性研究

杨朝晖 章辉 顾华敏 范广民 曹学全 王四玲 卢洪胜

目的 探讨微小RNA-21（miR-21）和信号转导及转录活化因子-3（Stat3）在宫颈癌中的表达情况及临床意义。方法采用实时荧光定量PCR检测48例宫颈癌及20例正常宫颈组织中miR-21和Stat3 mRNA的表达，免疫组化Envision法检测宫颈癌及正常宫颈组织中Stat3蛋白表达，分析miR-21和Stat3表达的相关性及其与宫颈癌患者临床病理特征的关系。结果miR-21和Stat3 mRNA在宫颈癌组织中的表达均显著高于正常宫颈组织（均P＜0.05），且miR-21和Stat3 mRNA的高表达呈正相关（r=0.631，P＜0.05）。Stat3蛋白在癌组织中的表达阳性率为79.17%（38/48）。Stat3的高表达和肿瘤低分化及有淋巴结转移有关（均P＜0.05）。结论miR-21在宫颈癌中的表达升高，可能和宫颈癌的增殖、侵袭转移有关。

宫颈癌 微小RNA 微小RNA-21 Stat3

宫颈癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于乳腺癌，并且呈持续上升，严重威胁着女性的健康。近年来，随着对微小RNA的基础研究越来越多，微小RNA在宫颈癌致癌机制中的作用研究取得了积极进展。微小RNA-21（miR-21）在多种肿瘤中表达上调，但其作用机制和靶基因尚未完全明确。Cao等[1]报道微小RNA可以通过多种途径调节信号转导及转录活化因子-3（signal transducers and activators of transcription 3，Stat3）的活性，从而诱导肿瘤的发生、发展，但miR-21和Stat3在宫颈癌中的作用机制和相关性未见报道。本研究采用实时荧光定量PCR检测48例宫颈癌组织中miR-21和Stat3的表达，免疫组化检测Stat3蛋白的表达，分析它们之间的相关性及其与患者临床病理特征的关系，为宫颈癌的分子诊断、评估预后及复发转移提供新的理论依据。

1 对象和方法

1.1 对象 收集2008年6月至2013年12月台州市中心医院妇产科行手术治疗的宫颈癌患者48例，术前未行放、化疗及内分泌治疗，年龄28～73岁，平均（48.0± 10.975）岁。组织病理类型的判断标准参照2003版WHO宫颈肿瘤的病理学分类。同时选取20例同期因子宫肌瘤行子宫全切术患者的宫颈组织，均经病理检查证实为正常，患者年龄32～61岁，平均（44.5±6.653）岁。

1.2 主要试剂 Trizol试剂购自美国lnvitrogen公司，M-MLV逆转录酶、RNA酶抑制剂、oligo dT、dNTPs等购自Takara公司，引物由上海英骏生物技术有限公司合成，鼠抗人Stat3单克隆抗体及免疫组化试剂盒（PV-9000）购自北京中杉生物有限公司。

1.3 方法

1.3.1 实时荧光定量PCR检测miR-21和Stat3 mRNA表达 取宫颈癌组织及正常宫颈组织标本，按Trizol试剂说明书提取总RNA，DEPC处理过的蒸馏水溶解。分别取宫颈癌组织及正常宫颈组织总RNA各1μg，miR-21茎环RT-PCR引物参考文献[2]，茎环结构逆转录引物序列为5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGT TGAGTCAACATC-3′。逆转录反应条件为16℃30min，42℃30min，75℃15min。PCR扩增miR-21上游引物为5′-ACACTCCAGCTGGGTAGCTT ATCAGACTGATG-3′，下游为5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′，PCR产物大小67bp。PCR反应条件：95℃10min变性；95℃15s，60℃1min，40个循环。所有反应均设立3个复孔。记录每个反应管中的荧光信号到达所设定的域值时所经历的循环数即Ct值，以U6作为内参照，采用相对定量法，以2-ΔΔCt表示肿瘤组织目的基因表达相对于配对的正常组织的变化倍数，其中ΔΔCt=（CtmiR-21-CtU6）肿瘤-（CtmiR-21-CtU6）正常。Stat3上游引物5′-AAG AGGCGGCAACAGATT-3′，下游引物5′-CGGTCTTGA-TGCCGAGGG-3′，反应条件及计算方法同上述。

1.3.2 免疫组化检测Stat3蛋白的表达 采用Envision法检测宫颈癌组织及正常宫颈组织中Stat3蛋白的表达，具体操作严格按照产品说明书进行。鼠抗人Stat3单克隆抗体工作浓度1∶100，抗原枸橼酸盐热修复。以PBS代替一抗作阴性对照。Stat3表达以细胞质中呈不同染色程度的棕黄色颗粒为阳性，少数位于细胞核。观察5个以上高倍视野（×400），计数不少于1 000个细胞中的阳性细胞数，阳性细胞数＜10%为阴性，≥10%为阳性。

1.4 统计学处理 应用SPSS 17.0统计软件，计量资料以表示，组间比较采用t检验及方差分析，计数资料组间比较用χ2检验或秩和检验分析，相关性分析采用Spearman相关分析。

2 结果

2.1 宫颈癌组织中miR-21和Stat3 mRNA表达

2.1.1 宫颈癌组织与正常宫颈组织中miR-21和Stat3 mRNA表达的比较 宫颈癌组织中miR-21的mRNA相对表达量为1.0546±0.3325，正常宫颈组织中为0.4510± 0.2341；宫颈癌组织中Stat3的mRNA相对表达量为0.5256±0.1034，正常宫颈组织中为0.2048±0.0508，宫颈癌组织中两者表达均高于正常宫颈组织，均有统计学差异（均P＜0.05）。miR-21、Stat3以及内参U6的实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线见图1-2。

图1 实时荧光定量PCR的扩增曲线（a：miR-21；b：Stat3；c：U6）

2.1.2 宫颈癌组织中miR-21和Stat3 mRNA的表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系 miR-21 mRNA的表达量与患者年龄、肿瘤大小、分化程度、有无淋巴结转移及FIGO分期均无关（均P＞0.05）。Stat3 mRNA的表达量与宫颈癌分化程度及淋巴结转移均相关（均P＜0.01），与患者年龄、肿瘤大小及FIGO分期均无关（均P＞0.05），见表1。

2.1.3 宫颈癌组织中miR-21和Stat3 mRNA表达的相关性分析 Spearman相关分析发现，宫颈癌组织中miR-

21和Stat3 mRNA的表达呈正相关（r=0.631，P＜0.05）。

2.2 宫颈癌组织及正常宫颈组织中Stat3蛋白表达的比较 Stat3蛋白染色后出现棕黄色颗粒，主要集中在细胞质，部分在细胞核中。宫颈癌组织中Stat3蛋白表达呈强阳性（38/48，79.17%），正常宫颈组织中Stat3蛋白低表达或无表达（6/20，30.00%），两者间比较有统计学差异（P＜0.05）。随着肿瘤分化程度减低，Stat3蛋白表达阳性率逐渐递增，Stat3蛋白的表达还与淋巴结转移相关（均P＜0.05），见图3-4和表2。

图2 实时荧光定量PCR的熔解曲线（a：miR-21；b：Stat3；c：U6）

表1 宫颈癌组织中miR-21和Stat3 mRNA的表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系

图3 Stat3在宫颈中分化鳞状细胞癌中的阳性表达（Envision染色，×200）

图4 Stat3在宫颈低分化鳞状细胞癌中的阳性表达（Envision染色，×200）

表2 宫颈癌组织中Stat3蛋白表达与宫颈癌患者临床病理特征的关系[例（%）]

3 讨论

近年来研究发现了一类内源性短链RNA，即miRNA，长度约为22nt，不编码蛋白质，但能够通过和靶基因mRNA部分或完全互补结合抑制其翻译或导致其降解而起到转录后沉默基因表达的作用，有可能作为一种生物标记，成为恶性肿瘤治疗的一个新靶点及肿瘤诊断和预后的分子标志物[3]。miR-21定位于17q23.1，具有癌基因特性，是miRNA家族中著名的癌基因，在胰腺癌及肺癌等恶性肿瘤中高表达[4-5]，并通过抑制凋亡而与肿瘤的发生及进展有关。本研究结果发现，miR-21的mRNA在宫颈癌组织中的表达量明显高于正常宫颈组织，与文献报道一致[6]，而在不同年龄、肿瘤大小、分化程度、有无淋巴结转移及FIGO分期的患者之间比较，其相对表达量无统计学差异。研究结果提示miR-21可能参与了宫颈癌的发生，在肿瘤形成过程中起到关键的调控作用[6]，而是否参与宫颈癌的侵袭和转移尚无确切的证据。

Stat3是信号转导与转录活化因子家族的重要成员，在正常组织中仅短暂表达，而在多种恶性肿瘤组织，如肝癌、乳腺癌和胃癌中呈持续性激活和高表达，并且与肿瘤的恶性程度及预后密切相关[7-8]。本研究结果显示Stat3 mRNA和蛋白在正常宫颈组织中也有表达，在宫颈癌组织中表达增高，并且随着宫颈癌组织分化的减低和淋巴结转移的发生，表达水平进一步升高。随着肿瘤向晚期进展，分化程度减低，Stat3被不断激活，进入细胞核，发挥抑制肿瘤细胞凋亡的作用[9]。同时，可能通过诱导靶基因 Survivin、VEGF、MMP家族等的表达，促使肿瘤细胞增殖，这在其他多种肿瘤中已得到验证[10-11]。

本研究通过对48例宫颈癌组织中的miR-21及Stat3 mRNA的相对表达量进行相关性分析，结果发现两者呈正相关。这提示miR-21可能调控Stat3表达，抑制肿瘤凋亡，促进肿瘤发生、发展。有文献报道Stat3可能结合miR-21的启动子调节其转录[12]，但是具体如何调节尚不清楚。

另外miR-21调控的靶基因还有多种，如PDCD4、PTEN、SPRY1、SPRY2及p53等[13-15]，它们在肿瘤的发生、发展中都发挥重要作用。miR-21如何调节Stat3以及其他靶基因，这些靶基因之间是否存在相互作用，相互作用的信号通路如何，还有待进一步研究。

[1]Cao Q,Li Y Y,He W F,et al.Interplay between microRNAs and the STAT3 signaling pathway in human cancers[J].Physiol Genomics,2013,45(24):1206-1214.

[2]Tang F,Hajkova P,Barton S C,et al.MicroRNA expression profiling of single whole embryonic stem cells[J].Nucleic Acids Res,2006, 34(2):e9.

[3]Fassan M,Croce C M,Rugge M.MiRNAs in precancerous lesions of the gastrointestinal tract[J].World J Gastroenterol, 2011,17(48):5231-5239.

[5]Sicard F,Gayral M,Lulka H,et al.Targeting miR-21 for the therapy of pancreatic cancer[J].Mol Ther,2013,21(5):986-994.

[6]MotoyamaK,InoueH,Mimori K,et al.Clinicopathological and Prognostic significance of PDCD4 and microRNA-21 in human gastric cancer[J].Int J Oncol,2010,36(5):1089-1095.

[7]Sonnenblick A,Shriki A,Galun E,et al.Tissue microarray-based study of patients with lymph node-positive breast cancer shows tyrosine phosphorylation of signal transducer and activator of transcription 3(tyrosine705-STAT3)is a marker of good prognosis[J].Clin Transl Oncol,2012,14(3):232-236.

[8]Xiong H,Du W,Wang J L,et al.Constitutive activation of STAT3 is predictive of poor prognosis in human gastric cancer[J].J Mol Med(Berl),2012,90(9):1037-1046.

[9] 惠慧,谢薇,吴磊,等.STAT3与Survivin在宫颈癌组织中的表达及意义[J].现代肿瘤医学,2011,19(8):1650-1654.

[10]Wang X F,Lin G S,Lin Z X,et al.Association of pSTAT3-VEGF

signaling pathway with peritumoral edema in newly diagnosed glioblastoma:an immunohistochemical study[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(9):6133-6140.

[12]Li Y,Wu R,Liu Z,et al.Enforced expression of microRNA-21 influences the replication of varicella-zoster virus by triggering signal transducer and activator of transcription 3[J].Exp Ther Med,2014,7(5):1291-1296.

[13]Damania P,Sen B,Dar S B,et al.Hepatitis B virus induces cell proliferation via HBx-induced microRNA-21 in hepatocellular carcinoma by targeting programmed cell death protein4(PDCD4)and phosphatase and tensin homologue(PTEN)[J].PLoS One,2014,9(3):e91745.

[14]Darimipourain M,Wang S,Ittmann M,et al.Transcriptional and post-transcriptional regulation of Sprouty1,a receptor tyrosine kinase inhibitor in prostate cancer[J].Prostate Cancer Prostatic Dis,2011,14(4):279-285.

[15]Ma X,Choudhury S N,Hua X,et al.Interaction of the oncogenic miR-21 microRNA and the p53 tumor suppressor pathway[J]. Carcinogenesis,2013,34(6):1216-1223.

Expression of miR-21 and Stat3 in cervical cancer and their clinicopathological significance

Objective To investigate the expression of microRNA-21(miR-21)and Stat3 in cervical cancer and their clinicopathologic significance.MethodsStem-loop real-time RT-PCR was used to examine the expression of miR-21 and Stat3 in 48 specimens of cervical cancer and 20 specimens of normal cervical tissue.Immunohistochemistry was used to examine Stat3 protein expression in the tumor tissue.The association of miR-21 and Stat3 expression with clinicopathologic features was analyzed.ResultsThe expression of miR-21 and Stat3 in cervical cancer tissues were significantly higher than that of normal tissues(P＜0.05).The expression rate of Stat3 in cervical cancer tissue was 79.17%(38/48).The expression of miR-21 was positively correlated with Stat3(r=0.631,P＜0.05).The expression of Stat3 was correlated with lower differentiation,lymph node metastasis in cervical cancer(P＜0.05).ConclusionThe expressions of miR-21 and Stat3 are up-regulated in cervical cancer, which may be involved in the development and progression of cervical cancer.

Cervical cancerMicroRNA MicroRNA-21 Stat3

2015-08-10）

（本文编辑：胥昀）

台州市科技局计划项目基金（131KY14、14SF04）

318000 台州市中心医院（台州学院附属医院）病理科