蚌毒灵散中黄芩的整体定量分析研究

文│樊克锋 汤法银（河南牧业经济学院）

孙素琴 周群（清华大学）

王新杰（北京亿森宝生物科技有限公司）

蚌毒灵散中黄芩的整体定量分析研究

文│樊克锋 汤法银（河南牧业经济学院）

孙素琴 周群（清华大学）

王新杰（北京亿森宝生物科技有限公司）

项目来源：河南省青年骨干教师项目基金：2013GGJS-191，河南省教育厅自然基金资助项目“近红外（NIR）对复方中黄芩药材快速定量分析的研究（2008A230010）

目前，中兽药散剂在临床应用中仍占绝对优势（《兽药典》中85%以上的中兽药制剂仍然是散剂），其复杂多样的化学成分及作用机理仍然无法完全明晰，这给评价中兽药药理药效和质量标准制定带来了极大的困难。目前惯用方法仍然是模仿化学药物的质量控制模式，即以已知单一或几个指标成分作为质量控制和评价标准，通过单一的定性和定量分析，判断中兽药（复方）是否“合格”并制定非客观质量标准。这样做似乎是找到了一种合理的方法来评价中兽药（复方）质量，但是这种方法忽视了中兽药的整体性和复方协同作用。所以不能简单说其中一个或几个成分对疾病起作用，为了更好地对中兽药（复方）进行全面整体的质量控制和评价，本实验利用近红外光谱技术和化学计量学，将中药散剂中的某种“中药整体”作为一个质量指标，即无论含有多少成分都将这种中药材看作一个整体。这样既避免了样品复杂前处理对物质造成的流失，也较好的符合了中兽医药整体观，同时更适合中兽药散剂原状态直接“无损快速”测定。

近红外光谱同计算机和化学计量学相结合可对物质进行非破坏分析。如在对药物的定量分析方面，将近红外光谱与偏最小二乘法（PLS）、主成分分析（PCA）及非线性人工神经网络方法等相结合非侵入地测量了银杏叶片、黄连浸膏粉、元胡止痛散等中药活性成分的含量和分布，及对甲璜酸加替沙星、头孢氨苄胶囊、扑热息痛片剂、甲氧苄胺嘧啶等进行了定量分析，均取得了满意的预测结果。

◎图1 70份蚌毒灵散剂样品的近红外光谱叠加图

◎图2 70份蚌毒灵散剂样品原始光谱预处理后的光谱图

一、实验

1.仪器设备及测试条件。仪器设备：近红外光谱仪采用布鲁克公司的VECTOR22-NIR型傅立叶变换近红外光谱仪，配有PbS和InGaAs检测器、外接积分球、样品旋转器和固体光纤探头；PentiumⅢPC机。

测试条件：样品粉末分别取适量放入石英样品杯中，分布均匀，轻轻压平。

测样方式：积分球漫反射；分辨率为8厘米-1；扫描次数：64次；扫描范围：12000～4000厘米-1；温度：20℃；空气湿度：60%；每个样品重复3次，求平均光谱。

2.实验样品材料来源及制备方法。样品材料来源：以2010年版《中国兽药典》二部中“蚌毒灵散”为研究对象，处方为：黄芩60克，黄柏20克，大黄10克，大青叶10克，即主药黄芩含量为60%，药材饮片购于北京同仁堂（郑州店）。

样品制备方法：分别取各味药材适量，低温干燥，取黄芩单独粉碎100目细粉，黄柏、大黄和大青叶按处方比例混合粉碎100目细粉，备用。依据处方要求，分别精密称量、等量递增混合制备黄芩含量5%～70%的70份样品，得训练集（用于建立模型）和预测集（评估模型的预测等能力）样本。其编号见表1。

表1 黄芩不同含量70份散剂样品编号

◎图3 训练集测定值与真实值之间的相关图（Rank:4 R2＝99.77 RMSECV＝0.963）

3.样品近红外光谱采集。将70份样品粉末分别取适量放入石英样品杯中，混合均匀，轻轻压平，按上述测试条件进行扫描，每个样品重复3次，求平均光谱，70份蚌毒灵散样品的近红外光谱叠加见图1。

4.定量校正模型的建立。

（1）光谱预处理方法的选择。通过比较不同预处理方法对RMSECV（均方差，即交叉验证误差均方根）和R2（相关系数）的影响，最终选择了VectorNormalization（矢量归一化）预处理的方法对70分样品进行建模。此时RMSECV分别为0.963；R2分别为99.77。预处理图谱如图2。

（2）建模谱段的选择。选择合适的波段对于建立定量模型来说是非常重要的。本文以RMSECV和R2为衡量的标准来选出模型最合适的波段。结果选择波段为6102～5446厘米-1，rank＝4。

（3）样品定量模型的建立。运用BrukerOPUS/QUANT22定量分析软件中PLS法进行数据处理，其中60份样品作为校正样品集，8份样品作为预测样品集。训练集样品通过软件分析，36、38号样品为建模溢出值，将其删除后，建立模型更为准确。用校正样品集进行内部交叉验证RMSECV＝0.963，R2＝99.77（图3），确定最佳主成分数为4（图4）。近红外光谱法测得值与真实值之间的绝对误差在±1%（图5）。

二、结果

将前述所建立的定量校正模型用于对8份样品进行预测，结果如表2。检验集预测结果显示，在黄芩的投药量相差10%的范围内预测结果还是比较准确的，可以成功的分出不同投药量的样品。

三、讨论

第一，在模型建立的过程中，取样和混合是非常重要的，药材混合是否均匀直接影响到模型建立的好坏。为了尽量消除混合不均匀的问题，首先在制样时按等量递增法混合，再者测定时从混合样品的不同部位取样，另外在测定过程中，采取多次测量取平均图谱的方法，尽量消除混合不均匀和颗粒大小不均匀对测量的影响。

第二，由于样品只是添加的黄芩量多少不同，在近红外原始光谱图上很难看出差异。但将近红外光谱技术与计算机技术和化学计量学相结合，对原始图谱进行必要的预处理之后，就会在处理过的图谱中显示出各个样品的不同，这种不同与化学值（称量值）是一一对应的。

第三，在建立模型的时候，本试验将黄芩作为一个整体，这是一种新的尝试。按不同的比例投入黄芩，不再测定指标成分黄芩苷的含量，而是将黄芩整体的投入量直接作为基础值。因此训练集测定值与真实值之间的相关图呈非常好的线性关系。虽然样品的含量不是分散的而是等比例增加的，但预测结果令人满意。

表2 检验集样品预测结果

◎图4 训练集RMSECV与Rank之间的相关图（Rank:4 R2＝99.77 RMSECV＝0.963）

◎图5 训练集绝对误差与真实值之间的相关图（Rank:4 R2＝99.77 RMSECV＝0.963）

四、结论

本实验将复方蚌毒灵散剂中“黄芩整体”当作一种指标，采用PLC法建立近红外光谱方模型，内部交叉验证RMSECV=0.963，R2=99.77，确定最佳主成分数为4。近红外光谱法测得值与真实值之间的绝对误差在±1%，基本上可以分出5%～70%的样品。通过预测值结果可以看出，样品近红外光谱与黄芩药材量之间存在一定的相关性，因此将该方法用于黄芩原药材占有量的测定基本可行，在扩大标准样品集的数量后，有望获得结果更可靠的数学模型。如果模型能够建立就可以很方便地监督投药量是否合乎处方，监督是否减少了贵重药材的投药量。

利用近红外光谱技术对中药复方中单味药材“整体定量”进行初步研究，尝试了将整体药材作为指标性成分，建立了快速定量检测处方中某种药材占有量的新方法。在建立模型的时候，按不同的比例将黄芩的投入量整体直接作为基础值，训练集测定值与真实值之间的相关图呈非常好的线性关系，模型的建立是成功的。可以将投药量的密度进一步减小，建立的模型可能会更好，这种新的尝试值得进一步研究。