基于离子选择性微电极的黄瓜细胞内硝酸盐测量

胡静��毛罕平+胡圣尧��温贻芳��于霜��+韩绿化+储建华+高新浩

摘要：描述了能够测量黄瓜叶片细胞内硝酸根离子活度和膜电位的双管微电极的制作和使用情况。扫描电镜显示电极尖端不易受黄瓜表皮毛的损坏并通过微操纵器的步幅来控制电极进入细胞的程度。硝酸根电极的标定曲线显示硝酸根离子选择性微电极对硝酸根离子有很好的敏感性，数据可靠。用双管电极测得的黄瓜叶片表皮细胞的硝酸根活度为165 mmol/L。结果证实之前用于大麦叶片的离子选择性电极也能成功地用于黄瓜叶片，因此可以用微电极技术来诊断黄瓜营养。

关键词：黄瓜；硝酸盐；选择性微电极；营养诊断

中图分类号： TS207.7文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0373-03

在20世纪的最后几十年，科技发达国家的温室园艺呈现出创新和技术高速发展的特点。技术应用不仅仅在大范围和高产量上，还主要在温室产业的可持续性上。可持续发展的焦点主要在产品的质量改进和对环境影响的大大减少上。但是在温室园艺上经常会出现氮、磷、钾、钙的失调，氮是限制植物生长和产量的主要因子，氮也是作物中许多重要有机物如蛋白质、核酸、叶绿素、酶、维生素、生物碱和一些激素的主要成分。硝态氮是绝大多数植物的主要氮素来源，由于硝态氮重要的营养作用，因此细胞内硝态氮的测量就显得尤为重要。微电极是一种能够直接刺入植物细胞的微小探针，通常参考电极置于外部测量溶液中，测量电极既能置于植物表面也能直接刺入单个细胞，离子选择性微电极能用于在体内估计细胞内的钾离子[1-3]、硝酸根离子活度[4]和pH值[5-7]等。微電极技术能在体内测量细胞内的离子活度，然而绝大多数的测量在根部[8-9]，因为叶片是相对薄的，并且叶片表面特性更复杂，微电极用于叶片测量的植物主要有大麦和小白菜[10-13]。黄瓜是最常见的温室作物，本研究制备了双管硝酸盐离子选择性微电极，并用它第一次测量了黄瓜叶片的细胞内硝酸盐浓度，以量化温室作物的营养需求并建立精确的温室管理模型。量化产品改进并减少环境污染是非常重要的。

1材料与方法

1.1植物材料

供试黄瓜品种为津优1号，在20～25 ℃下的湿纱布上对黄瓜种子催芽4 d后，把大小一致的苗移栽到盆里，盆的开口径为22 cm，高度为20 cm，种植基质为珍珠岩。黄瓜苗生长在温室里，保持湿度（70±10）%，用山崎配方种植黄瓜，黄瓜长至7叶1心时用微电极方法进行叶片测量。

1.2黄瓜叶片表面特性

黄瓜叶片（5 mm×6 mm）清洗后用4%戊二醛溶液固定，经过脱水处理后用单面刀片进行徒手切片，切成2 mm左右厚的横断面。将制备好的样品粘在导电胶上，离子溅射镀膜，喷[CM（25]金厚度为20[KG3]nm，然后将其粘贴在扫描电镜样品台上，在[CM）]〖LM〗 15 kV 加速电压下进行观察、拍照。

1.3硝酸根离子敏感剂（nitrate sensor）的配制

用0.000 1 g的电子天平依次精确称取0.006 0 g甲基-N，N，N-三十二烷基铵硝酸根离子（methyltride-docylammonium-nitrate，MTDDA-NO3-，Sigma公司生产），0.001 0 g溴化甲基-三苯基磷酸铵（methyltriph-enylphosphomium bromide，Fluca公司生产），0.065 0 g 2-硝基苯基-辛烷基乙醚（2-nitrophenyl octyl ether，Fluca公司生产），0.023 0 g聚乙烯（PVC，Fluca公司生产）和0.005 0 g硝化纤维素（nitrate celluclose），然后加入0.45 mL四氢呋喃溶解[14]。由于四氢呋喃会溶解塑料，配制硝酸根离子敏感剂所用的器械用具应避免使用塑料制品。配制好的硝酸根离子敏感剂应封存在玻璃容器中，第一次使用之前充分振荡后再使用。

1.4双阻微电极的制作

采用PMP-107型编程多管拉制仪，拉制微电极通过设置热值水平（heat level）、加热时间（time）和拉力（pull）使双管玻璃管拉制成理想的微电极。所使用双管玻璃管由管径不同的2根单管玻璃管粘合而成，其内径分别为0.800 mm和0.400 mm，外径分别为1.000 mm和0.600 mm，粗管和细管中粘合有纤维丝，以使溶液能够迅速地进入电极尖部，其直径分别为0.100 mm、0.080 mm。根据我们的测定，理想的微电极针尖直径为0.8～1 μm，加热温度过高，针尖过长或过软都不适合插进叶片细胞中。

1.5双孔硝酸根离子选择性电极的制备及测量

在通风橱中，将拉制好的双孔玻璃管置于140 ℃下烘烤30～60 min，除去残存在玻璃管内的水蒸气和杂质，然后用 1 mL 注射器在双孔玻璃管中粗管的尾部滴入1～2滴2%的二甲基二氯硅烷（DCMS，Fluca公司生产）进行硅化，使二甲基二氯硅烷的蒸气进入玻璃管的尖部，目的是在粗管尖部形成一层疏水层，以利于硝酸根离子敏感膜的形成和作用。硅化后，在140 ℃下继续烘烤1～1.5 h，使过量的二甲基二氯硅烷蒸发掉。然后，将已配制好的硝酸根离子敏感剂（nitrate sensor）灌入双阻玻璃微管的粗管中，放入硅胶干燥的密闭容器中保存48 h以上以使多余的四氢呋喃蒸发。制备好的双阻硝酸根离子选择性微电极，用1 mL的注射器在双孔玻璃管的细管中注入100 mmol/L KCl，用作测定膜电位，在粗管中注入100 mmol/L KCl和100 mmol/L KNO3的混合溶液，用于测定由于硝酸根离子敏感膜的存在使硝酸根离子跨膜运动而产生的膜电位[9]。细胞内测量由MultiClamp 700B 放大器和数模转换器（Digidata 1322）获得（Axon Instruments，USA），采样频率为10 Hz。pClamp 9.2（Axon Instruments）软件用来采集和分析数据。

1.6硝酸盐选择微电极的标定

在使用双阻离子选择性微电极测定膜电位之前应该进行标定（表1）[14]，以确保：（1）硝酸根离子敏感剂对硝酸根离子的敏感性，来验证硝酸根离子敏感剂配制质量的好坏。（2）硝酸根离子敏感剂对硝酸根离子敏感的程度，用经计算机软件计算得到的3个参数（P1、P2、P3）来表示。P1为微电极参比电位；P2为电位差对-lg（aNO3-）作图所得曲线的斜率，即标定溶液中硝酸根离子活度每改变1个数量级，所产生的电位的差值；P3为选择性离子电极的检出限浓度。理想的P2在48～58 mV之间，P3<1.0 mmol/L。P2大于58 mV，说明电极尖部被破坏；小于48 mV，微电极对硝酸根离子的敏感度不高，检测限较高。在测定之后，也应该对微电极进行标定，以证实在测定过程中没有破坏微电极的尖部和所充灌形成的[JP3]硝酸根离子敏感膜。测定前后所计算得到相近的P1、P2、P3才作为可靠的数据保留。测定之后将不能进行标定的电极弃掉。

1.8数据分析

计算硝酸根离子活度参数P1、P2、P3，用Sigmaplot绘图软件计算，根据公式E=P1-P2×[-lgaNO3- ]+P3[15]计算得到硝酸根离子活度。

2结果与分析

2.1叶片表面特性

从图1-A上看表皮毛的间隔500～800 μm，电极尖端小于1 μm，因此只要足够小心，表皮毛就不会破坏电极尖端，表皮细胞见图1-B。表皮细胞的平均宽度是7 μm，在电极尖端碰到叶片时，电势差会有一個剧烈的变化，微操纵器的单个步幅是0.2 μm或者0.04 μm，因此在电极尖端碰到叶片时，通过微操纵器的步幅来控制电极进入细胞的程度。

2.2微电极的标定

硝酸根离子选择性电极在刺入植物叶片细胞前后都应该对微电极进行标定，以证实在测定过程中微电极的尖部和所充灌形成的硝酸根离子敏感膜没有受到破坏。测定前后所计算得到相近的P1、P2、P3才作为可靠的数据保留，测定之后不能进行标定的电极及其数据放弃。

图2所示为测定前后硝酸根电极的标定曲线。从图2上可以看出，硝酸根离子选择性电极的测定点电位及标定曲线在测定前后的重叠性都很高，测定前标定所得到的P1=-77.8 mV，P2=-54.0 mV，P3=0.000 122 1 mmol/L，测定后标定所得到的P1=-78.6 mV，P2=-53.3 mV，P3=0.000 148 4 mmol/L。 P1为微电极参比电位，本研究中所制备硝酸根离子选择性电极的参比电位在-78 mV左右，P2为标定溶液中硝酸根离子活度每改变1个数量级，所产生的电位的差值。 理想的P2绝对值在48～58 mV之间，P2大于 58 mV，说明电极尖部被破坏；小于48 mV，说明微电极对硝酸根离子的敏感度不高，检测限较高。本研究中所制备硝酸根离子选择性电极的P2绝对值在53～ 54 mV之间，说明微电极对硝酸根离子的敏感度很好，满足使用的要求。P3为选择性离子电极的检出限浓度，P3<1.0 mmol/L。本研究中所制备硝酸根离子选择性电极的检出限浓度在10-4 mmol/L量级，检出限精度非常高。本研究标定前后3个参数值相近，说明硝酸根离子选择性微电极对硝酸根离子有很好的敏感性，且在整个测定过程中一直保持良好的选择性，没有因为插入叶片而被影响。

2.3黄瓜叶片细胞内硝酸根离子活度的测定

当在其中一根玻璃管中灌入100 mmol/L的KCl，另一根玻璃管中灌入硝酸根离子敏感剂后，插入黄瓜叶片细胞内所得的膜电位和硝酸根离子的活度（图3）。图3-A表示记录到的细胞内的膜电位-163 mV，图3-B表示硝酸根离子选择电极所记录到的膜电位-198 mV，计算得到膜电位A与B之间的差值为-35 mV，应用 Simaplot 软件模拟 Nicolsky-Eisenman 校正曲线和计算离子活度的方法，得到的细胞内硝酸根离子的活度，大约为165 mmol/L（图3-C）。

3讨论

本研究第一次报道了温室内作物的离子选择性微电极的细胞内记录。离子选择性微电极主要用在测量根上，很少有关于叶片的报道，主要原因是叶片很容易振动，很难稳定记录。而且叶片表皮细胞的蜡质层也是很难刺穿的，电极很容易断掉，但是只要优化电极的尖端和电极的形状，以上这些困难就可以克服。总而言之，本研究证实了先前用于大麦叶片的离子选择性微电极也能成功地测量黄瓜叶片，因此可以用微电极技术来诊断黄瓜的营养，这种技术也可能成为诊断作物营养的标准化技术。

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