3种天然抗氧化剂对维生素D2稳定性的保护作用

胡代花��+张嘉昕��+韩豪��王永吉

摘要：应用超高效液相色谱，分别测定白藜芦醇、茶多酚及大豆异黄酮与维生素D2在1 ∶[KG-3]1、1 ∶[KG-3]10、10 ∶[KG-3]1这3种质量比例混合下，放置10、26、36 d后样品中维生素D2稳定性变化。结果表明，以1 ∶[KG-3]1、1 ∶[KG-3]10、10 ∶[KG-3]1质量比例添加的3种天然抗氧化剂均对维生素D2稳定性具有一定的保护作用，且随着放置时间的延长，对维生素D2的稳定性保护作用愈明顯。其中以 1 ∶[KG-3]10 质量比例添加对维生素D2的稳定性保护作用最佳，添加3种天然抗氧化剂36 d后维生素D2的存留率均在84%以上，与空白对照相比增加72.12%、68.08%、75.32%。茶多酚、大豆异黄酮及白藜芦醇3种天然抗氧化剂均对维生素D2具有较好的稳定性保护作用，其中以1 ∶[KG-3]10质量比例混合时效果较佳。

关键词：维生素D2；稳定性；茶多酚；大白藜芦醇；豆异黄酮；天然抗氧化剂

中图分类号： R927.11文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0363-03

〖FQ（78。26，ZX，DY-W〗〖CDF13〗〖HT6SS〗[HJ1.3mm]

稿日期：2015-12-31

基金项目：陕西省自然科学基金（编号：2014JQ2083）；陕西省2011陕南秦巴山区生物资源综合开发协同创新中心项目[编号：QBXT-Z（P）-15-15]；陕西省汉中市科技局项目（编号：维生素D2，别称钙化醇或麦角骨化醇，是维生素D家族的重要一员，能调节钙磷的代谢，促进骨骼的健康，在临床上用于预防和治疗佝偻病、骨质软化及甲状旁腺功能低下等疾病[1-3]。由于维生素D2 性质不稳定，遇光、热、氧等易降解而失效[4-6]，导致体内生物利用度降低，难以保证常规制剂质量稳定性，从而限制了它在药品、食品、保健食品等领域的广泛应用。目前常用β-环糊精包被或微囊化技术提高维生素D2及其制剂产品的稳定性[7-9]。

茶多酚、大豆异黄酮及白藜芦醇是源于我国优势资源的3种天然抗氧化剂，具有较好的抗氧化性，并显示良好的抗衰老、抗肿瘤等生物活性，在药品、保健食品、化妆品等中具有广阔的应用前景[10-16]；另一方面，超高效液相色谱作为一种高效分析技术，其高分辨度、高分析效率、低溶剂消耗在色谱分析中具有显著优势，并在食品质量安全等分析检测中广泛应用[17-21]。笔者所在的课题组前期建立了乙醇直接提取、超高效液相色谱分离的方法测定维生素D，方法简便、快捷、灵敏，准确度高，分析总周期大大缩短，适合批量化分析检测，并用建立的方法对几种市售维生素D保健食品和药品进行了测定，取得较满意的结果。

为考察茶多酚、大豆异黄酮及白藜芦醇3种天然抗氧化剂对维生素D2稳定性的影响，本研究应用超高效液相色谱法分别测定白藜芦醇、茶多酚及大豆异黄酮与维生素D2在 1 ∶[KG-3]1、10 ∶[KG-3]1、1 ∶[KG-3]10这3种质量比例混合下，在4 ℃冷藏干燥条件下放置10、26、36 d后混合样品中维生素D2的稳定性变化，分析白藜芦醇、茶多酚及大豆异黄酮对维生素D2稳定性保护作用，最终旨在寻找天然维生素D2抗氧化稳定剂，为维生素D2相关产品及制剂的开发提供理论依据。

1材料与方法

1.1仪器

超高效液相色谱-质谱联用仪（Waters ACQUITY-UPLC-TQD）；Sartorius万分之一电子天平（BSA224S-CW）；低速离心机（Eppendorf 5810 R）；超声波清洗仪（KQ-500E）；240 mm玻璃干燥器；电热恒温水浴锅（HWSY21-K）；冰箱（海尔BCD-278TAJ）。

1.2试剂

维生素D2（分析纯，上海晶纯有限公司），维生素D2标准品（SUPELCO，100 mg），无水乙醇为分析纯，白藜芦醇（98%，[JP3]陕西森弗生物技术有限公司），茶多酚（98%，陕西森弗生物技术有限公司），大豆异黄酮（98%，陕西森弗生物技术有限公司），变色硅胶（2.0～5.6 mm，山东青岛裕宝精细化工有限公司）。

维生素D2标准储备液 （100 μg/mL ）：准确称取 0.010 0 g 维生素D2于 100 mL容量瓶中，用乙醇溶解并定容至刻度；维生素D2标准使用液：准确吸取维生素D2标准储备液 10 mL于 100 mL容量瓶中，用乙醇定容至刻度，该溶液浓度为10.0 μg/mL。

1.3样品处理

将维生素D2与白藜芦醇、茶多酚、大豆异黄酮3种抗氧化剂分别按照质量比1 ∶[KG-3]10、1 ∶[KG-3]1、10 ∶[KG-3]1各称取9份，置于 5 mL 塑料离心管中（样品称取质量见表1），加入2 mL无水乙醇，40 ℃ 超声30 min，置于恒温水浴锅中60 ℃挥干溶剂，所得样品在冰箱4 ℃下置于24 mm干燥器中干燥保存（干燥器中加入变色硅胶）。分别于10、26、36 d后取出各处理3个重复样品，在5 mL离心管中加入2 mL乙醇，40 ℃超声 30 min，离心10 min（3 500 r/min），残渣继续加入2 mL乙醇，40 ℃超声30 min，离心10 min（3 500 r/min）。合并上清液，离心10 min（3 500 r/min）。依次将1 ∶[KG-3]10样品溶液稀释20倍，1 ∶[KG-3]1样品溶液稀释100倍，10 ∶[KG-3]1样品溶液稀释200倍，维生素D2空白对照溶液稀释100倍后，吸取上清液过 0.45 μm 膜，滤液直接进色谱系统分析。整个过程避光操作。每个处理3次重复。

2结果与分析

2.1未添加天然抗氧化剂维生素D2稳定性

未添加天然抗氧化剂的维生素D2稳定性较差，经处理后在 4 ℃ 冷藏干燥保存条件下，造成维生素D2大量损失，10、26、36 d的存留率分别为88.21%、68.32%、50.00%，且在0.05水平差异显著，其中维生素D2在保存26、36 d的损失率高达3168%、50%（表2至表4）。

2.2以1 ∶[KG-3]1质量比例添加3种天然抗氧化剂对维生素D2稳定性影响

以1 ∶[KG-3]1质量比例添加的3种天然抗氧化剂均对维生素D2稳定性具有一定的保护作用，且随着放置时间的延长，对维生素D2稳定性的保护作用愈明显。保存10 d测定结果表明，添加3种天然抗氧化剂后维生素D2的存留率均在90%以上，且三者之间在5%水平无显著差异，三者与空白对照也无显著差异。保存26 d测定结果表明，添加3种天然抗氧化剂后维生素D2的存留率均在73%以上，且三者在5%水平无显著差异，其中添加茶多酚后维生素D2的存留率与空白对照保存26 d的存留率差异显著，而添加大豆异黄酮和白藜芦醇后维生素D2的存留率与空白对照的存留率均无显著差异。保存36 d测定结果表明，添加3种天然抗氧化剂后维生素D2的存留率均在72%以上，三者之间在5%水平无显著差异，但是均与空白对照保存36 d的存留率差异显著，其中添加茶多酚后 36 d 维生素D2存留率与空白对照相比增加了58%（表2）。

对于茶多酚而言，保存10 d和26 d的存留率无显著差异，保存10 d和36 d的存留率差异显著，保存26 d和36 d的存留率也无显著差异；对于大豆异黄酮和白藜芦醇而言，保存10 d和26、36 d的存留率差异显著，保存26 d与36 d的存留率无显著差异（表2）。

3结论

未添加天然抗氧化剂的维生素D2稳定性较差，经处理后在4 ℃冷藏干燥保存条件下，造成维生素D2大量损失，10、26、36 d的存留率分别为88.21%、68.32%、50.00%；以 1 ∶[KG-3]1、1 ∶[KG-3]10、10 ∶[KG-3]1质量比例添加的3种天然抗氧化剂均对维生素D2稳定性具有一定的保护作用，且随着放置时间的延长，其对维生素D2的稳定性保护作用愈明显。其中以1 ∶[KG-3]10质量比例添加对维生素D2的稳定性保护作用最佳，添加3种天然抗氧化剂36 d后维生素D2的存留率均超过84%，与空白对照相比增加了72.72%、68.08%、75.32%。

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