百尾参多糖的提取工艺及抗氧化性评价

曹剑锋��+任朝辉��+芦静波��+王自布��+夏慧芳��+夏丽莎��+刘丹

摘要：水提醇沉法提取百尾参多糖，以多糖得率为指标，考察提取时间、提取温度、料液比、提取次数对多糖提取量的影响，在单因素试验基础上以正交试验优化提取工艺参数。通过测定百尾参多糖清除1，1-二苯基-2-苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和·OH自由基能力、还原力及螯合力来评价其抗氧化活性。结果表明，百尾参多糖水提取的最佳工艺条件为提取温度100 ℃、提取时间4 h、料液比1 g ∶[KG-3]50 mL、提取次数4次，在此条件下，百尾参多糖的提取率为15.68%，以正交试验极差分析得出，温度对百尾参粗多糖提取影响最大。百尾参多糖清除DPPH自由基和·OH自由基、还原力及螯合力的IC50值分别是4.8、1.8、3.9、0.24 mg/mL，百尾参多糖具有显著体外抗氧化活性。

关键词：百尾参；多糖；提取；抗氧化

中图分类号： R284.2文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0343-04

百尾参为百合科（Liliaceae）万寿竹属（Disporum）植物万寿竹[Disporum cantoniense（Lour.）Merr.]的根及根茎，别称白味参、白龙须等。百尾参为多年生草本药用植物，在中国南北均有分布，具有润肺止咳、健脾消积的功效，传统用于虚损咳喘、痰中带血、肠风下血、食积胀满等症状[1-2]。以百尾参为主药的市售复方制剂有贵州百灵生产的咳速停系列药物。陈磊等对其化学成分研究发现，百尾参含有多种活性成分，如黄酮类化合物以及糖苷类化合物、萜类以及挥发油、有机酸等[3-6]。现代药理学研究表明，百尾参具有止咳、抗菌、抗炎等多种药理作用[7-8]；关于百尾参多糖提取的工艺研究未见报道。本研究以百尾参为原料，水提醇沉法提取多糖。在单因素试验基础上以正交试验对百尾参多糖提取工艺进行优化，通过测定百尾参多糖清除1，1-二苯基-2-苦基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基和·OH自由基能、还原力及螯合力来评价其抗氧化活性。为百尾参多糖在食品及相关领域的开发利用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料

百尾参药材采自贵州省安顺市，经贵州师范学院鉴定为百合科（Liliaceae）万寿竹属（Disporum）植物万寿竹[Disporum cantoniense（Lour.）Merr.]；ferrozine，DPPH，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司；95%乙醇溶液、苯酚、浓硫酸、铁氰化钾、氯化亚铁、葡萄糖、磷酸氢钾、维生素C等均为国产分析纯。

恒温水浴锅，上海梅香仪器有限公司生产；真空抽滤机，郑州长城科工贸有限公司生产；电子天平，上海精密科技仪器有限公司生产；冻干机，河南兄弟仪器设备有限公司生产；分光光度计，上海精密科技仪器有限公司生产；离心机，江苏正基仪器有限公司生产；干燥箱，天津市泰斯特仪器有限公司生产。

1.2方法

1.2.1水提醇沉提取工艺

百尾参干粉→蒸馏水浸提 →4 000 r/min 离心10 min→上清→减压浓缩至原体积10%→4倍体积乙醇醇沉→3 500 r/min离心10 min→沉淀物→洗涤→百尾参粗多糖。

1.2.2多糖得率测定与计算

多糖含量以苯酚-硫酸法测定[9]。以干燥至恒质量的葡萄糖配制标准液，于490 nm波长处测得的吸光度，绘制標准曲线，得葡萄糖标准曲线方程，计算多糖得率：

[JZ]提取率=[SX（]比色液浓度（μg/mL）×稀释倍数×250〖〗供试样品质量（g）×106[SX）]×100%。

1.2.3单因素试验和正交试验设计

参照杨林等的方法[10]设置单因素试验：考察提取温度、提取时间、料液比、提取次数对多糖提取率的影响。并对多糖提取率进行计算，每组试验重复3 次。

在单因素试验的基础上，以百尾参多糖提取率（Y）为响应值，提取温度（A），提取时间（B），料液比（C）、提取次数（D）为试验因素，在4因素3水平上对百尾参多糖提取工艺进行优化，正交试验因素水平见表1。

1.2.4多糖纯化

将百尾参粗多糖以活性炭脱色、saveage法脱蛋白，经醇沉后透析、冷冻干燥[11-12]；即得到纯化后的热水浸提的多糖。此纯化的多糖用于后续抗氧化活性评价试验。

1.2.5多糖的抗氧化活性

1.2.5.1 DPPH 清除活性测定

参照韦献雅等的方法[13-14]，稍有改动，用95%乙醇配制浓度为2×10-4 mol/L的 DPPH溶液。取“1.2.4”节制备的多糖样品配制40、80、160、320、640、1 280、2 000 μg/mL百尾参糖溶液，在8支试管中分别加入各质量浓度的样品糖溶液和蒸馏水2 mL，精确加入2 mL DPPH溶液，混匀30 min后517 nm测定吸光值，以维生素C为对照，每份样品平行操作3 次，根据公式（1）计算DPPH清除率：

[JZ（]DPPH清除率=（D0-D样品）/D0×100%。[JZ）][JY]（1）

式中：D0为2 mL DPPH溶液与2 mL蒸馏水混合后的吸光度；D样品为2 mL DPPH乙醇溶液与样品混合后的吸光度。

1.2.5.2清除·OH能力的测定

参照葛霞等、吴向阳等的方法[15-16]，取“1.2.4”节制备的多糖样品配制80、160、320、640、1 280、2 560、4 000 μg/mL的糖样品溶液，在8支10 mL的试管中分别加入3 mmol/L的FeSO4溶液1 mL，3 mmol/L水杨酸-乙醇溶液1 mL，0.05%的H2O2溶液1 mL，立即混匀，再分别加入各质量浓度样品糖溶液1 mL，蒸馏水管为空白对照。37 ℃反应30 min后510 nm测量吸光度。以维生素C为对照，每份样品平行操作3 次，根据公式（2）计算·OH清除率：

[JZ（]清除率=（D0-D样品）/D0×100%。[JZ）][JY]（2）

式中：D0为空白对照液的吸光值；D样品为加入不同浓度糖溶液的吸光值。

1.2.5.3Fe2+螯合能力的测定

参照文献[17]的方法将 “12.4”节制备的多糖样品配制成80、160、320、640、1 280、2 560、4 000 μg/mL的溶液，在9支试管中分别再加入3.7 mL 蒸馏水，0.1 mL 2 mmol的FeCl2溶液，分别加入各质量浓度样品液1 mL，混合均匀后加入0.2 mL 5 mmol/L的ferrozine启动反应，空白管为不加糖液蒸馏水管，标准管用蒸馏水代替FeCl2溶液，室温放置30 min后562 nm处测定吸光度，以EDTA 做对照，每份样品平行操作3 次。根据公式（3）计算金属螯合能力（%）：

[JZ（]金属螯合能力=[D0-（D样品-D标准）]/D0×100%。[JZ）][JY]（3）

式中：D0为空白对照的吸光值；D样品为加入不同浓度糖溶液的吸光值；D标准为蒸馏水代替FeCl2溶液的吸光值。

1.2.5.4总还原能力的测定

参照文献[18]的方法加以适当改进，在8支试管中分别加入0、80、160、320、640、1 280、2 560、4 000 μg/mL “1.2.4”节制备的多糖样品溶液0.2 mL，再加入0.5 mL磷酸缓冲液（0.2 mol/L，pH值6.6）和0.5 mL 1%铁氰化钾。混匀后在50 ℃放置20 min，加入0.5 mL 10%三氯乙酸后3 000 r/min离心10 min，吸取上清液1 mL，加入1 mL蒸馏水和0.5 mL 0.1%三氯化铁，混匀后在700 nm波长下测定吸光度D。以维生素C为对照。平行测定3次。

2结果与分析

2.1葡萄糖标准曲线

对葡萄糖标准溶液与对应的吸光度，绘制葡萄糖标准曲线，拟合线性方程为y=0.016 11x，r2=0.9992，可根据方程计算多糖得率。

2.2单因素试验

2.2.1料液比对粗多糖提取率的影响从图1可以看出，开始随着料液比的增加，多糖的得率随之增加，当料液比为1 g ∶[KG-3]60 mL 时多糖得率达到最高，随后随着料液比的继续增加，多糖提取得率并没有明显增加，并稍呈下降趋势。

2.2.2温度对粗多糖提取率的影响从图2可以看出，起初随着温度的升高，百尾参多糖的得率相应增加。当温度达到90 ℃时多糖提取率达到最高，到100 ℃时则稍有降低。

2.2.3时间对粗多糖提取率的影响从图3可以看出，随着时间延长，百尾参多糖的得率增加，3.0 h达到最高值，当提取时间大于3.0 h时，多糖的得率有所下降。

2.4.2DPPH自由基清除能力从图6可以看出，百尾参多糖对DPPH自由基具有一定的清除作用，其清除能力随样品质量浓度增加而增强（半数抑制浓度IC50为8.4 mg/mL），相比之下百尾参多糖对DPPH自由基的清除作用较维生素C弱。

2.4.3百尾参多糖的金属螯合力从图7可以看出，百尾参多糖在较小浓度时随着质量浓度增加对金属的螯合力迅速升高，当多糖质量浓度为0 .32 mg/mL时，对金属螯合力达80%以上，显示了较强的螯合金属离子或惰化金属离子的能力，IC50值为0.24 mg/mL。

2.4.4百尾参多糖的还原能力从图8可以看出，维生素C的吸光度随着质量浓度的增加明显上升，与维生素C的吸光度相比白尾参多糖随浓度增加吸光度增加缓慢，但呈现较好的量效关系，表明还原能力逐渐增强，抗氧化能力也增强。IC50为3.9 mg/mL。

3结论

通过正交设计得出百尾参多糖的最佳工艺条件为：提取温度100 ℃，提取时间4 h，提取次数4次，料液比 1 g ∶[KG-3]50 mL，在此条件下多糖得率15.68%，该优化结果对百尾参多糖开发利用和生产有重要的参考价值。体外抗氧化试验结果表明，百尾参多糖对羟自由基和DPPH自由基都有一定的清除能力，且具有一定的还原力和较强的金属螯合能力，表明百尾参多糖具有较好的抗氧化活性。因而百尾参多糖在天然抗氧化剂和功能食品的开发方面都有良好的应用潜力。

参考文献：

[1]邱德文，杜江. 中华本草（苗药卷）[M]. 贵阳：贵州科技出版社，2005：54-55.

[2]贵州省药品监督管理局.贵州省中药材：民族药材质量标准[M]. 2003年版. 贵阳：贵州科技出版社，2003：162.

[3]吴文利，张雁萍，王道平，等. 野生和人工栽培百尾参挥发油GC-MS分析[J]. 贵阳医学院学报，2011，36（3）：255-258.

[4]甘秀海，赵超，梁志远，等. 百尾参化学成分研究[J]. 贵州师范大学学报：自然科学版，2014，32（1）：64-66.

[5]陈磊. 百合科两种药用植物化学成分及生物活性研究[D]. 天津：天津大学，2009.

[6]Chen L，Su Y F，Yin Z Y，et al. Flavonoids from Disporum cantoniense（Liliaceae）[J]. Biochemical Systematics and Ecology，2009，37（5）：609-612.

[7]任朝辉，曹剑锋，夏丽莎，等. 百尾参祛痰止咳、抗炎作用研究[J]. 安徽农业科学，2015，43（11）：116-118.

[8]甘秀海，梁志远，王瑞. 百尾参抑菌活性研究[J]. 贵阳学院学报：自然科学版，2012，7（1）：43-44，52.[HJ1.73mm]

[9]王文平，郭祀远，李琳，等. 苯酚-硫酸法测定野木瓜中多糖含量的研究[J]. 食品科學，2007，28（4）：276-279.[ZK）]

[10]杨林，刘翠花，刘刚，等. 西藏野生尊麻水溶性多糖提取工艺的优化设计[J]. 食品工业科技，2013，34（2）：35-37.

[11]Chen Y，Xie M Y，Li W J，et al. An effective method for deproteinization of bioactive polysaccharides extracted from lingzhi（Ganoderma atrum）[J]. Food Science and Biotechnology，2012，21（1）：191-198.

[12]程超，李伟，汪兴平. 平菇水溶性多糖结构表征与体外抗氧化作用[J]. 食品科学，2005，26（8）：55-57.

[13]韦献雅，殷丽琴，钟成，等. DPPH法评价抗氧化活性研究进展[J]. 食品科学，2014，35（9）：317-322.

[14]Li W，Liang H，Zhang M W，et al. Phenolic profiles and antioxidant activity of litchi（Litchi chinensis Sonn.）fruit pericarp from different commercially available cultivars[J]. Molecules，2012，17（12）：14954-14967.

[15]葛霞，陈婷婷，蔡教英，等. 青钱柳多糖抗氧化活性的研究[J]. 中国食品学报，2011，11（5）：59-64.

[16]吴向阳，范群艳，仰榴青，等. 匙羹藤粗多糖的提取及其清除羟自由基活性研究[J]. 食品科学，2008，29（1）：107-110.

[17]杨少辉，宋英今，王清华，等. 雪莲果体外抗氧化和自由基清除能力[J]. 食品科学，2010，31（17）：166-169.