大鲵虹彩病毒套式PCR诊断方法的建立及应用

王芳��+康超��+李永霞��+余波+周思旋

摘要：根据GenBank中大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白MCP基因序列，设计2对特异性的引物，通过对第1步和第2步PCR反应条件进行优化，建立大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白套式PCR诊断方法。结果表明，该方法重复性好，第1次PCR扩增敏感性达10 pg/mL，第2次PCR敏感性是1 fg/mL，对锦鲤疱疹病毒、斑点叉尾[XCZ11.tif；%95%95，JZ]病毒、嗜水气单胞菌、柠檬酸杆菌、黄杆菌DNA扩增结果均为阴性。表明建立的套式PCR方法适合于大鲵虹彩病毒临床样品的快速诊断。

关键词：大鲵虹彩病毒；套式PCR；临床样品

中图分类号： S852.65+9.1文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0291-03

近年来，大鲵人工养殖发展迅速，工厂化水平较高，苗种之间流通比较多，加之今年大鲵价格下降，养殖户大量采购苗种，忽视引种检疫，造成疾病大量暴发。其中，大鲵虹彩暴发最为严重，在陕西、四川、贵州等地报道较多，该病毒可引起大鲵大面积死亡[1-3]。目前，大鲵虹彩病毒的疫苗还处于研究阶段，市面上还没有商品化的疫苗[4-6]。因此，对大鲵虹彩病毒病的早期诊断及防治尤为重要。本研究根据GenBank中大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白MCP基因序列，设计2对特异性的引物，根据PCR反应条件优化，建立大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白套式PCR诊断方法，以期为临床样品的快速诊断、防治大鲵虹彩病毒病提供科学依据。

1材料与方法

1.1试验材料

毒株、菌株和细胞：大鲵虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒、斑点叉尾[XCZ11.tif]病毒、嗜水气单胞菌、柠檬酸杆菌、黄杆菌均由贵州重大疫病监测防制重点实验室保存。鲤上皮瘤细胞购自上海拜力生物科技有限公司。

主要试剂：MIX PCR酶、核酸染料、1×TAE电泳缓冲液、DL2000购自北京天根生物科技有限公司。细菌基因组DNA提取试剂盒，病毒基因组DNA提取试剂盒，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2试验方法

1.2.1引物设计根据GenBank中大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白MCP基因序列，设计2对引物。

1.2.2病毒和细菌核酸的提取（1）病毒细菌核酸。将大鲵虹彩病毒液接种于鲤上皮瘤细胞，待细胞出现病变后收集细胞毒液，将其放入-70 ℃冰箱反复冻融3次，5 000 r/min离心10 min，取上清液200 μL用病毒基因组DNA试剂盒提取基因组。（2）细菌核酸。细菌核酸DNA提取参照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书进行。（3）组织样品。取患病大鲵肝脏组织约1.0 g，加入0.1 mol/L PBS缓冲液2 mL进行研磨，然后置于-70 ℃反复冻融3次，5 000 r/min离心 10 min，取上清液490 μL加入10%SDS 5 μL，蛋白酶K 5 μL（20 mg/mL），55 ℃孵育30 min，5 000 r/min离心10 min，取上清液200 μL用病毒基因组DNA试剂盒提取基因组。

1.2.3套式PCR扩增条件优化对套式PCR的退火温度（50、55、60 ℃）和引物浓度（5、10、20 μmol/L）进行优化。第1次和第2次PCR反应体系和反应程序相同：在25 μL体系中加上下游引物各1 μL（5、10、20 μmol/L）、MIX PCR酶 12.5 μL、模板2 μL，ddH2O加至25 μL。反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃（55 ℃、60 ℃）1 min，72 ℃ 1 min，30个循环；最后72 ℃延伸10 min。取10 μL PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳。

1.2.4敏感性试验将提取的病毒和细菌核酸用核酸蛋白仪检测后，进行10倍稀释用于套式PCR反应。从每个稀释度中取2 μL作为模板进行第1次PCR扩增，如第1次PCR扩增为阴性，再将第1次PCR产物取出2 μL作为模板，进行第2次PCR扩增，以确定建立的套式PCR敏感性。

1.2.5特异性试验以大鲵虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒、斑点叉尾[XCZ11.tif]病毒、嗜水气单胞菌、柠檬酸杆菌、黄杆菌DNA为模板分别进行第1次和第2次PCR反应，以确定建立的套式PCR特异性。

1.2.6建立的套式PCR对临床样品的检测应用建立的套式PCR对贵州省20个大鲵养殖场采集的46份大鲵肝脏（其中，21份为有临床症状的病鲵，25份为无临床症状但感染虹彩病毒的养殖场采集的样品），44份大鲵饵料鱼病料，20份大鲵养殖场水样（其中9个养殖场以前发生过虹彩病毒），20份引种的鲵苗进行检测，同时参照Mao等建立的普通PCR方法[7]进行对比。

2结果与分析

2.1套式PCR反应条件优化

25 μL反应体系中最佳反应条件为退火温度55 ℃，引物浓度10 μmol/L，第1次和第2次PCR能有效扩增出目的片段，分别为700、300 bp，引物间无非特异性片段产生（图1）。序列送生工生物工程（上海）有限公司测序，结果与GenBank中大鲵虹彩病毒MCP基因相似性为99.9%。

2.2敏感性试验

大鲵虹彩病毒DNA经蛋白质核酸仪测定浓度为 1 μg/mL，经10倍稀释的病毒核酸进行套式PCR，以检测方法的敏感性。结果（图2）表明，第1次PCR扩增产物大小约700 bp，大鲵虹彩病毒 DNA最低检测量为10 pg/mL。在第1次PCR扩增未见DNA亮带，取第1次PCR产物2 μL进行第2次PCR扩增，扩增产物大小约300 bp。第2次PCR敏感性为1 fg/mL（图3）。

2.3特异性试验

以大鲵虹彩病毒、锦鲤疱疹病毒、斑点叉尾[XCZ11.tif]病毒、嗜水气單胞菌、柠檬酸杆菌、黄杆菌DNA为模板用2对引物进行PCR反应。结果（图3、图4）显示，大鲵虹彩病毒DNA第1次和第2次扩增均为阳性，而锦鲤疱疹病毒、斑点叉尾[XCZ11.tif]病毒、嗜水气单胞菌、柠檬酸杆菌、黄杆菌DNA第1次和第2次扩增均为阴性。

2.4建立的套式PCR对临床样品的检测

应用建立的套式PCR检测46份大鲵肝脏样品阳性率为36.9%（17/46），普通PCR方法阳性率为19.5%（9/46）。套式[CM（25]PCR检测44份大鲵饵料鱼病料阳性率为0%，普通PCR[CM）]

方法阳性率为0%。套式PCR检测20份大鲵养殖场水样阳性率为10%（2/20），普通PCR方法阳性率为0%。套式PCR检测20份引种的鲵苗阳性率为20%（4/20），普通PCR方法阳性率为15%（3/20）。

46份大鲵肝脏样品中21份为有临床症状的病鲵套式PCR检测阳性率为42.8%（9/21），普通PCR方法阳性率为42.8%（9/21）。25份为无临床症状但感染过虹彩病毒的养殖场采集的样品阳性率为32%（8/25），普通PCR方法阳性率为4.7%（1/21）。9个养殖场以前发生过虹彩病毒水样阳性率22.2%（2/9），普通PCR方法阳性率为0%。

3讨论

近2年，随着大鲵市场的走低，养殖户对大鲵疫病防控的重视度下降。大鲵虹彩病毒是目前养殖大鲵最大的威胁，感染虹彩病毒可导致养殖场出现大规模大鲵死亡，而虹彩病毒的暴发多是引种所致。因此，建立快速简便经济适用的引种检疫方法对大鲵虹彩病毒病的防治尤为重要。

目前，研究者主要依据大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白设计引物建立快速的诊断方法。周勇等根据大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白设计引物，建立大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法，敏感性约1.1×10-3 pg/μL病毒核酸，较之常规PCR的敏感度高出约1 000倍[8]。李惠芳等依据虹彩病毒蛙病毒属主衣壳蛋白基因，建立虹彩病毒蛙病毒属病毒实时荧光PCR检测方法，该方法对虹彩病毒蛙病毒属成员（新加坡石斑鱼虹彩病毒除外）的检测有高度的特异性，敏感性达到4.5×10-3 pg/μL，比传统PCR的敏感度高出100倍[9]。这些荧光定量PCR检测方法对人员和设备的要求较高，在基层水产技术推广站推广多只配备了普通PCR仪器，该方法推广较难。刘星星等据大鲵蛙病毒主要核衣壳蛋白MCP设计合成4条特异性引物建立环介导等温扩增检测方法，最低检测限为5 copies/μL，而巢氏PCR和常规PCR的检测限为 50 copies/μL和5×103 copies/μL，该LAMP方法检测时间较快，但成本较高[10]。

套式PCR成本较低，敏感性较普通PCR高100倍左右，敏感性略低于荧光定量PCR，适合基层水产技术推广站推广应用。贾坤同等依据大菱鲆红体病虹彩病毒的腺苷三磷酸酶基因序列，设计了特异性的引物，建立了一种检测大菱鲆红体病虹彩病毒的套式PCR方法，该方法比普通PCR敏感性100倍[11]。本研究建立的诊断方法敏感性达到1 fg/mL，比普通PCR敏感性1 000倍。对感染过虹彩病毒的养殖场进行大鲵样品和养殖用水样品检测发现该养殖场还存在阳性样本，说明该养殖场可能还存在隐性感染。因此，建立的诊断方法可应用于大鲵虹彩病毒引种检疫和隐性感染检测，有利于大鲵养殖场虹彩病毒的净化。

参考文献：[HJ1.7mm]

[1][JP3]耿毅，汪开毓，李成伟，等. 蛙病毒感染致养殖大鲵大规模死亡的电镜观察及PCR检测[J]. 中国兽医科学，2010，40（8）：817-821.

[2]余波，王芳，杨莉，等. 一例人工养殖大鲵感染虹彩病毒和嗜水气单胞菌的诊治[J]. 广东农业科学，2013，40（12）：134-135.

[3]周小愿，张星朗，吉红，等. 大鲵虹彩病毒的形态结构及其包涵体特征[J]. 淡水渔业，2015（1）：62-66.

[4]孙建滨，曾令兵，张辉，等. 大鲵虹彩病毒β-丙内酯灭活方法的研究[J]. 淡水渔业，2013（3）：66-71.

[5]周小愿，张星朗，韩亚慧，等. 大鲵虹彩病毒转瓶规模化培养条件研究[J]. 山地农业生物学报，2015（1）：32-35.

[6]曾宪辉，曾令兵，周勇，等. 大鲵虹彩病毒主衣壳蛋白MCP 基因DNA 疫苗的构建及其免疫效果[J]. 中国水产科学，2015，22（5）：1055-1067.

[7][JP3]Mao J，Hedrick R P，Chinchar V G. Molecular characterization，sequence analysis，and taxonomic position of newly isolated fish iridoviruses[J]. Virology，1997，229（1）：212-220.

[8]周勇，曾令兵，孟彦，等. 大鲵虹彩病毒TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 水产学报，2012，36（5）：772-778.

[9]李惠芳，吕建强，岳志芹，等. 虹彩病毒蛙病毒属病毒实时荧光PCR检测方法的建立[J]. 华中农业大学学报，2008，37（2）：172-176.[ZK）]

[10]刘星星，耿毅，汪开毓，等. 大鲵蛙病毒LAMP检测方法的建立[J]. 中國兽医学报，2015，35（4）：558-564.

[11]贾坤同，梁玉波，宋晓玲，等. 海水养殖鱼类中虹彩病毒无症状感染的套式PCR分析[J]. 中国水产科学，2009，16（5）：758-764.