金莲花初代培养探索

郑志新��+范翠丽��+孙洪生

摘要：为了探讨不同因素对金莲花初代培养的影响，最终筛选金莲花初代培养的最适外植体、灭菌处理及诱导或分化培养基，为金莲花离体快繁和规模化、工厂化育苗提供理论依据。以金莲花叶片、叶柄、根颈和根为外植体，以乙醇和HgCl2为灭菌剂，以MS为基本培养基，通过不同浓度的6-BA和NAA配比，进行金莲花初代组织培养研究。结果显示，叶柄是金莲花再生初代培养的最佳外植体，其通过愈伤组织诱导途径建立再生体系，最佳的灭菌组合是75%乙醇灭菌10 s+0.1% HgCl2 灭菌4min，最适培养基为MS+6-BA 8.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L；其次是根颈，以不定芽分化途径为主，最佳灭菌组合为75%乙醇灭菌20 s+0.1% HgCl2 灭菌6 min，最适培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

关键词：金莲花；初代培养；灭菌处理；叶柄；根颈不定芽；愈伤组织；诱导培养基；工厂化育苗

中图分类号： S682.19文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0066-03

金莲花（Trollius chinensis Bunge）属毛茛科（Ranunculaceae）金莲花属（Trollius），别称“金芙蓉”“金梅草”“旱莲花”等，是稀有野生药用植物，喜湿喜凉，多生长在海拔1 800～2 700 m 的疏林或山地，集中分布在河北、山西、内蒙和东北等地，其中以河北承德地区所产金莲花药材质量最佳[1-5]。近年来，人们逐渐认识到金莲花的药用价值和观赏价值，对其大量采摘，再加上旅游、开荒、放牧等行为，金莲花野生资源及其生境遭到了极大的破坏，价格逐年上涨。因此，对金莲花进行引种驯化和人工栽培具有非常重要的意义。目前，金莲花的人工栽培方法常见种子直播法和幼苗移栽法[6]。杨玉芳等采取实生播种进行金莲花幼苗培育，结果发现金莲花幼苗死亡率很高，且幼苗苗期栽培管理困难，难以达到迅速培育优质种苗的目的[7]，而组织培养技术可以在短时间内培育大量优质种苗[8-9]。本试验对金莲花的初代培养进行详细的探索，以期为金莲花的工厂化育苗、次生代谢物生产等提供理论及技术依据。

1材料与方法

1.1材料

随机选取在温室播种的金莲花幼苗（苗期3个月），种子购自河北承德。

1.2试验时间及地点

试验于2015年1—5月在河北北方学院组织培养实验室进行。

1.3试验方法

1.3.1金莲花初代培养外植体的筛选将金莲花幼苗从温室取回，用清水冲洗干净根部基质后置于流水中冲洗2 h，再用洗衣粉水浸泡30 min，接着用流水冲洗4 h，将金莲花幼苗分成叶片、叶柄、根颈和根4个部分，先用75%乙醇表面消毒 10 s，再用0.1% HgCl2灭菌6 min，无菌水冲洗干净，接种于MS+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA的培养基上。

1.3.2灭菌剂及处理时间对金莲花叶柄和根颈初代培养的影响外植体筛选出来的叶柄和根颈经过清洗处理后，分别置于无菌瓶中，用75%乙醇和0.1% HgCl2的不同组合进行外植体表面灭菌，筛选最佳的灭菌处理时间组合。

1.3.3培养基组成对金莲花叶柄和根颈初代培养的影響以MS为基本培养基，在此基础上添加不同浓度的6-BA和NAA，筛选叶柄愈伤组织诱导和根颈分化的最适培养基。

1.3.4培养基的制备和培养条件基本培养基中添加蔗糖30 g/L、琼脂3.5 g/L，于121 ℃高温灭菌20 min，灭菌前pH值调至5.8，培养室温度控制在（25±2） ℃，光照14 h/d。

1.4试验数据统计分析

接种1周后统计污染率，2周后统计死亡率、成活率、愈伤组织诱导率和不定芽分化率等，记录数据的同时观察外植体生长状况并拍照。污染率=污染外植体数/接种外植体数×100%；成活率=成活外植体数/接种外植体数×100%；死亡率=死亡外植体数/接种外植体数×100%；愈伤组织诱导率=诱导愈伤组织外植体数/成活外植体数×100%；分化率=分化根颈数/成活根颈数×100%。

所得数据采用Excel 2010和SPSS 17.0进行统计、方差分析和多重比较（Duncans法）。

2结果与分析

2.1不同外植体的初代培养情况

将处理过的金莲花幼苗分成叶片、叶柄、根颈和根4个部分，分别接种在MS+4.0 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA上，观察其各自的变化情况。1周后，叶片有13.33%被污染，5000%死亡，只有16.67%有愈伤组织形成，且愈伤组织相对较多（图1），其余的20%无生长表现，死亡叶片最初表现为颜色逐渐变黑，而后死亡；叶柄的污染率和死亡率与叶片相比相对较低，分别只有7.00%、24.00%，叶柄的愈伤组织诱导率较高，达到了52.00%，愈伤组织颜色发白，紧实度相对较差，稍显疏松，但是愈伤组织相对很多（图2）；叶片和叶柄均没有不定芽分化。将根颈接入相同培养基，2周后只有435%出现污染，其余全部有新的不定芽萌发，但是没有愈伤组织形成（图3），可能因为根颈是作为完整植物存在的缘故。根系因为生长在基质当中，所含的杂菌较多，所以在相同的灭菌条件下，污染率较高，达到57.78%，但是死亡率也高，达到38.89%，其余的3.4%没有任何生长表现（表1）。由此可知，叶柄是金莲花初代培养的最佳外植体选择，其次是根颈，叶片也可以考虑，而根系则不能使用。

2.2灭菌时间对金莲花初代培养的影响

2.2.1灭菌剂及处理时间对金莲花叶柄初代培养的影响通常情况下，75%乙醇和0.1% HgCl2结合是常用的外植体灭菌组合，不同的外植体因为其幼嫩程度和所携带杂菌的量不同而对具体的灭菌时间会有差别。由表2可知，在75%乙醇灭菌时间相同时，随着0.1% HgCl2灭菌时间延长，污染率下降，死亡率增加。用75%乙醇灭菌10 s时，HgCl2灭菌 4 min 和 6 min 之间的差别不大，HgCl2灭菌4 min时成活率达到7800%，只比6 min多6.00百分点；而当HgCl2灭菌时间达到8 min时，污染率为0，而死亡率达到了92.00%，说明HgCl2对幼嫩的叶柄有较强的毒害作用。同样，当HgCl2灭菌时间一致时，随着75%乙醇表面灭菌时间的增加，叶柄污染率逐渐下降，灭菌死亡率逐渐增大，叶柄组织成活率逐渐下降，HgCl2灭菌时间为8 min，只有75%乙醇灭菌10 s的叶柄组织有成活，可知在75%乙醇和0.1% HgCl2的共同作用下，HgCl2的作用占主导地位。针对叶柄的组织培养，最佳的外植体处理组合为75%乙醇灭菌10 s+0.1% HgCl2灭菌 4 min，此时叶柄的污染率虽达到18.00%，但是死亡率最低，只有4.00%，成活率也最高，达到78.00%。

2.2.2灭菌剂及处理时间对金莲花根颈初代培养的影响以根颈为外植体进行组织培养时，在75%乙醇处于相同处理时，随着HgCl2灭菌时间的增加，根颈的污染率下降，死亡率增加，这与叶柄的表面灭菌效果是一致的；当HgCl2灭菌时间一致时，随着75%乙醇表明处理时间的延长，根颈同样表现出与叶柄相同的变化趋势（表3），可能是因为根颈底部有少量根系的存在使得其所携带的杂菌相对于叶柄偏多，所以根颈的最佳表面灭菌处理组合为75%乙醇20 s+0.1% HgCl2 6 min，此时的成活率达到了90.00%。

2.3培养基组成对金莲花初代培养的影响

2.3.1培养基组成对金莲花叶柄愈伤组织诱导的影响表4表明，将叶柄接种在以MS为基本培养基附加不同浓度 6-BA（4.0、8.0 mg/L）和NAA（0.5、1.0、1.5、2.0 mg/L）培养基上，约1周后有白色愈伤组织形成，呈絮状疏松态，10 d 左右愈伤组织逐渐增多，2周以后愈伤组织开始变黑。具体的愈伤组织诱导情况和叶柄伤口的规格有着非常重要的关系，叶柄粗壮，愈伤组织出现得早且多，叶柄细弱，愈伤组织不出现或是出现得相对晚，这可能和叶柄内部所含营养物质的量有关，而叶柄的长短对于愈伤组织诱导的影响不大。从表4可知，不同浓度的NAA对叶柄的初代培养有一定的影响，但与6-BA的结合效果则呈现出不一致的变化规律。当6-BA 使用浓度为4.0 mg/L时，叶柄的愈伤组织诱导率在NAA为1.0 mg/L时达到最大，随着NAA浓度的增大，愈伤组织诱导率开始下降，在NAA为2.0 mg/L时，愈伤组织诱导率只有25.00%，只有NAA1.0 mg/L的一半不到；当6-BA的使用浓度为8 mg/L时，随着NAA使用浓度的增大，愈伤组织诱导率也一直增加，在NAA为2.0 mg/L时，愈伤组织诱导率为85.00%，此时6-BA/NAA的值是一样的，说明细胞分裂素和生长素的比例及使用浓度对于愈伤组织的诱导都具有重要的影响，因此MS+8.0 mg/L 6-BA+2.0 mg/L NAA是叶柄愈伤组织诱导的最佳培养基。

2.3.2培养基组成对金莲花根颈初代培养的影响生长素和细胞分裂素的配合使用，对芽的诱导效果好于细胞分裂素的单独作用，也好于生长素的单独作用，即在一定浓度的细胞分裂素（或生长素）的基础上，添加一定浓度的生长素（或细胞分裂素），对于不定芽的诱导，即根颈的分化有一定的促进作用，因为生长素可促进腋芽的生长，细胞分裂素可以促进细胞分裂和器官分化[10]。当NAA浓度为0.1 mg/L时，随着 6-BA 浓度的增加，根颈分化率逐渐下降，可见低浓度的6-BA对于根颈的分化具有促进作用；而当NAA浓度为 0.5 mg/L，随着6-BA浓度的增加，根颈分化率增加，这与NAA 浓度为0.1 mg/L时的结果正好相反（表5），可见6-BA/NAA的值对于根颈的分化比各自的使用浓度作用更关键，因此根颈分化的最佳培养基为MS+1.0 mg/L 6-BA+01 mg/L NAA。

3结论与讨论

3.1结论

在植物的离体快繁过程中，初代培养的建立是快繁的第1步。在金莲花的初代培养过程中，叶柄是最佳的外植体，其次是根颈；因叶柄和根颈的组织幼嫩程度及所携带杂菌的差异[CM（25]，各自的灭菌处理组合表现不同，其中叶柄以75%乙醇灭[CM）]

2灭菌6 min效果最佳；同时二者的分化途径也有明显的差异，叶柄以愈伤组织诱导途径为主，最适培养基为MS+6-BA 8.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L，而根颈以不定芽分化途径为主，最适培养基为MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L。

3.2讨论

3.2.1外植体的选择及灭菌对试验效果的影响选择叶片、叶柄、根颈和根系分别作为外植体进行初代培养，在对其进行灭菌时，发现影响污染率的主要原因在于：如果灭菌时间短，只能钝化部分细菌；如果灭菌时间长，虽大部分细菌可被灭死，同时植物组织也会被杀死，因此在灭菌这一环节，污染是最大的障碍[11]，克服这一矛盾也是控制污染率的有效途径。在选定的4种外植体中，叶柄表面光滑，克服这一矛盾相对容易，具有较好的愈伤组织诱导效果，是最佳的外植体选择，其次是根颈，虽灭菌较叶柄难度增加，但是作为1株完整的植株存在，有不定芽的分化且具有很高的成活率，可以作為外植体的补充存在。

3.2.2激素对愈伤组织诱导和不定芽分化的影响一般认为，诱导愈伤组织或进行不定芽分化的关键条件在于培养条件，而培养条件中的激素是最为重要的，外源激素是植物愈伤组织诱导或不定芽分化中不可缺少的组成部分。通常情况下，生长素和细胞分裂素对保持愈伤组织的形成或不定芽的分化是非常必要的，尤其是二者有效结合时，对愈伤组织形成或不定芽诱导具有强烈的刺激作用[12]。本试验以叶柄为外植体时，在6-BA浓度为4.0 mg/L时，NAA浓度为1.0 mg/L表现最好；在6-BA浓度为8.0 mg/L时，NAA浓度为 2.0 mg/L 表现最好，虽6-BA和NAA的浓度差异很大，在其愈伤组织诱导率上表现出不同的变化趋势，但因其6-BA/NAA的浓度比值均为20，因此表现出最佳的愈伤组织诱导率。以根颈为外植体时，因其具有不同的器官分化途径，对于6-BA和NAA的浓度也表现出不同的适应性，以MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L为最佳的不定芽分化培养基，高浓度的细胞分裂素对其起抑制作用。

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