鸡源志贺菌IpaC基因表达载体的构建及其在毕赤酵母中的表达

韩志霞+马金玉+王雪云+蒋大伟+刘芳+许兰菊+李克宇

摘要：为使IpaC基因表达产物保持天然的生物学活性，实现在酵母表达系统中高效表达，本研究在不改变IpaC蛋白氨基酸序列的情况下，根据酵母密码子偏爱性优化合成IpaC#基因，分别构建真核表达载体pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#，然后将线性化重组质粒电转化至毕赤酵母X-33中，对阳性转化子用SDS-PAGE及Western blot检测其表达产物。结果表明，经SDS-PAGE及Western blot检测，仅在pGAPZαA-IpaC#/X-33重组菌表达产物菌体沉淀中检测到大小为70 ku的目的蛋白，实现了鸡源志贺菌IpaC# 基因在毕赤酵母中的胞内表达，从而验证毕赤酵母表达系统与外源基因序列的相关性，为进一步提高鸡源志贺菌IpaC基因在毕赤酵母中的高效表达提供科学依据，对研究该病的发病机制具有重要意义。

关键词：鸡源志贺菌；IpaC基因；毕赤酵母；优化密码子；pGAPZαA；真核表达

中图分类号：Q786；S852.61 文献标志码：

文章编号：1002-1302（2016）08-0039-04

志贺菌可以感染多种物种，不仅是人，志贺菌还可以引起猪、鼠、狐狸、兔、牛等多种动物痢疾，其中以幼年动物患病率最高，严重的会导致死亡[1]。在志贺菌侵袭肠道过程中，毒力大质粒上Ⅲ型分泌系统分泌的IpaC蛋白通过介导细胞骨架重排而使志贺菌趁机侵入肠上皮细胞，而且只有重组纯化的IpaC蛋白才能够在一定程度上恢复志贺菌的侵袭能力[2]。在分子水平上，IpaC蛋白不同结构域具有不同生物学功能[3-5]。志贺菌对人的侵袭感染机制的研究比较深入。鸡源志贺菌拥有与人源菌株相同的IpaC蛋白分子[6-8]，但是至今尚不清楚鸡肠上皮细胞是否存在与人肠上皮细胞相似的IpaC蛋白受体分子。目前，鸡源志贺菌IpaC基因的克隆表达在原核表达系统表达技术已经比较成熟[9-11]，但目前国内外在毕赤酵母表达系统中的研究较少。因此，为使IpaC基因表达产物保持天然的生物学活性，为研究鸡肠上皮细胞上的IpaC蛋白受体分子提供研究基础，本研究通过根据酵母表达系统对密码子的偏爱性，对鸡源志贺菌IpaC基因进行优化合成，分别构建真核表达载体pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#，使IpaC和IpaC#整合到酵母染色体中，从而验证毕赤酵母表达系统与外源基因序列的相关性，为进一步提高鸡源志贺菌IpaC基因在毕赤酵母中的高效表达提供科学依据，对研究该病的发病机制具有重要意义。

1材料与方法

1.1菌株及载体

原核重组载体pET32a-IpaC/BL21为河南农业大学牧医工程学院微生物学实验室构建保存；酵母真核载体pGAPZαA由河南农业大学尹清强教授惠赠；宿主菌大肠杆菌（Escherichia coli） TOP10购自上海北诺生物技术有限公司；毕赤酵母菌株X-33为河南科技大学张春杰教授惠赠。

1.2酶与试剂

rTaq DNA聚合酶、DL2000、DL5000均购自TaKaRa宝生物工程（大连）有限公司；限制性内切酶EcoRⅠ、XbaⅠ均购自Fermentas公司（美国）；T4连接酶购自于New England Biolabs（英国）公司；SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒及质粒DNA小量提取试剂盒均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR引物合成和重组质粒的测序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。蛋白胨、酵母膏、Agar power均购自OXIOD公司；琼脂糖凝胶购自GENVIEW公司；ZeocinTM购自invitrogen公司；鼠源 6-His单克隆抗体（Anti-His Tag Mouse Monoclonal Antibody），购自美国Abbkine试剂公司；羊抗小鼠IgG-HRP，购自索莱宝公司；IpaC蛋白免疫血清及鸡源志贺菌灭活疫苗免疫血清均由笔者实验室制备并保存。

1.3IpaC#基因序列的合成

根据酵母密码子偏爱性，在不改变氨基酸序列的情况下，对IpaC基因原序列进行优化，由北京英茂盛业生物科技有限公司合成，并将基因序列克隆到pUCE载体上，命名为pUCE-IpaC#。

1.4引物设计与合成

根据鸡源志贺菌IpaC基因与IpaC#基因全序列及毕赤酵母表达载体pGAPZαA多克隆位点序列分别设计1对引物P1、P2和P3、P4，上游引物加上EcoRⅠ、下游引物加上XbaⅠ这2个酶切位点（斜体加粗为酶切位点），并根据载体pGAPZαA序列设计检测引物P5、P6，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，已经进行特异性检测。序列如下：

1.5重组载体构建

分别以pET32a-IpaC和pUCE-IpaC#为模板进行PCR扩增，将扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测并切下目的条带，用普通琼脂糖凝胶试剂盒回收目的片段。回收产物和质粒pGAPZαA用EcoRⅠ和XbaⅠ限制性内切酶同时进行双酶切并经过琼脂糖凝胶电泳检测正确后，分别将IpaC和IpaC#基因双酶切产物与载体pGAPZαA双酶切产物在T4连接酶的作用下16 ℃连接过夜。将连接产物转化至感受态大肠杆菌TOP10，在含ZeocinTM抗性平板上进行筛选。挑取阳性单克隆，经菌液PCR、质粒双酶切鉴定和序列分析。获得的重组质粒命名为pGAPZαA-IpaC、pGAPZαA-IpaC#。

1.6重组质粒转化酵母宿主菌X-33

大量提取质粒pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#，用限制性内切酶AvrⅡ进行单酶切线性化，电泳后用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收，分别电转化至酵母菌X-33感受态细胞中，电转条件为：1.6 kV，25 μF，400 Ω，电击时间43 ms。电击完毕后，马上将1 mL冰預冷的1 mol/L山梨醇溶液加入菌体中，吹打混匀，转至1.5 mL EP管中，30 ℃静置培养1～2 h。取100 μL菌体悬液涂布于含有抗生素Zeocin浓度为100 μg/mL的YPD固体培养基上，待菌液完全吸收后，将平板置于30 ℃恒温培养箱中培养1～3 d，直至单菌落出现，同时电转空质粒pGAPZαA作对照。

1.7高抗筛选

挑取在ZeocinTM浓度为100 μg/mL平板上的单菌落，分别刺种在ZeocinTM浓度为500、1 000、2 000 μg/mL的YPD平板上，置于30 ℃恒温培养箱中培养2～3 d，直至有单菌落出现。将高抗性阳性克隆接种于Zeocin浓度为100 μg/mL的YPD平板上培养2～3 d，直至有单菌落出现。将高抗阳性转化子按照酵母基因组DNA小量提取试剂盒说明书操作提取酵母基因组DNA，利用检测引物P5、P6进行PCR扩增，并将PCR扩增产物送往生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。

1.8重组毕赤酵母表达产物检测

挑取鉴定正确的重组酵母单菌落接种于液体YPD培养基中，于30 ℃、250 r/min下振荡培养过夜。次日，取0.2 mL过夜培养物接种于100 mL液体YPD培养基中，于30 ℃、250 r/min 下振荡培养。分别在0、24、32、48、60、72、84、96、108、120、144 h的各个时间点收集上清和细胞样品10 mL，用于SDS-PAGE及Western blot分析，同时设立pGAPZαA/X-33表达为对照组。将各个不同时间点收集的菌液在4 ℃离心机中，于5 000 r/min下离心5 min，分别取菌体沉淀和上清。沉淀转移至无菌的EP管中。将收集的培养基上清用超滤法浓缩后进行SDS及Western blot检测。Western blot分别用His单抗、IpaC蛋白免疫血清及鸡源志贺菌灭活疫苗免疫血清进行特异性检测。

2结果与分析

2.2重组载体的鉴定结果

挑取转化后平板上的单菌落过夜培养，各取1 μL作模板进行PCR扩增，结果显示，电泳出现1条约1 107 bp的特异性条带，与目的基因片段大小一致（图1-A）。提取的质粒pGAPZαA-IpaC#和pGAPZαA-IpaC经EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切电泳出现2条带，其中1条条带为载体质粒，约3 084 bp，另1条条带片段长约1 097 bp，酶切结果与预期结果相一致（图1-B）。对重组质粒测序结果分析，结果表明IpaC基因及IpaC#基因均位于pGAPZαA质粒α因子信号肽序列下游，具有正确的阅读框。

2.3高抗性阳性转化子的鉴定

以转化有线性化的重组质粒pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#的酵母基因组为模板，以α-Factor sequencing primer和3′ AOX1 sequencing primer为引物进行PCR，若线性化的含目的基因的重组质粒与酵母成功重组则应扩增出[FL）]

长度为1 333 bp的片段，线性化的质粒pGAPZαA与酵母成功重组则应扩增出长度为299 bp的小片段，pGAPZαA-IpaC为阳性对照。经1%琼脂糖凝胶检测，结果（图2）与预期一致，PCR产物经测序，线性化的重组质粒已经成功整合到酵母基因组中。

2.4重组酵母表达产物SDS-PAGE电泳结果

分别挑取pGAPZαA-IpaC/X-33和pGAPZαA-IpaC#/X-33阳性酵母菌培养表达，不同时间取的样品中上清和菌体沉淀进行SDS-PAGE电泳及考马斯亮蓝染色，与空载体对照菌比较X-33菌体沉淀样品用带His单抗作Western blot检测，结果如图4-A所示，菌体沉淀中蛋白大小位置与预期一致，在108 h时表达量最高。将84、96、108、120、144 h取得的样品用IpaC蛋白免疫后血清抗体作Western blot检测，结果如图4-B所示，蛋白大小位置与预期一致。将84、96、108、120、144 h取得的样品用志贺菌全菌体疫苗菌免疫的血清抗体作Western blot检测，结果如图4-C所示，蛋白大小位置与预期一致。

3结论与讨论

真核表达系统克服了原核表达系统持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，过量表达可能导致非生理反应，目的蛋白常以包涵体形式表达，导致产物纯化困难的缺点，而真核表达系统能诱导基因的高效表达，可达105倍，为其他系统所不及，可以严格调控基因表达，人为地调控基因表达量。因此，利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前，基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。[FL）]

毕赤酵母表达系统可使外源对蛋白进行加工修饰，使得表达的外源蛋白具有类似天然蛋白质的构象[12]。而本研究选择的真核表达载体pGAPZαA以GAP为启动子，在表达过程中不须要添加甲醇，操作更为简单，其含有α信号因子，利用该信号因子可将目的蛋白分泌到培养基中获得纯度较高的蛋白[13-14]。

影响外源基因在毕赤酵母中表达量的因素很多，其中外源基因自身的特点是影响表达量的重要因素，包括密码子使用情况、GC含量等。国内外很多研究通过将外源基因的密码子进行优化，使外源基因的密码子使用频率符合毕赤酵母的密码子偏好性的要求，取得很好的效果[15-18]。本研究通过对IpaC基因的分析发现，该基因中含有毕赤酵母的稀有密码子，基于这种情况，本研究根据毕赤酵母的密码子偏好性，对鸡源志贺氏菌来源的IpaC基因进行优化改造，在不改变其氨基酸序列的基础上，选择毕赤酵母偏爱型的密码子，并调整基因的GC含量，使其更加符合毕赤酵母的要求。优化后的IpaC#基因与原始IpaC基因序列相比，共改变了269个碱基，涉及207个氨基酸，GC含量由原来的38.83%变为 40.02%，而在毕赤酵母中GC含量一般為40%～42%，优化合成的目的基因GC含量与毕赤酵母相符。

本研究分别构建了真核表达载体pGAPZαA-IpaC和pGAPZαA-IpaC#，重组菌的表达产物经SDS-PAGE及Western blot检测，在pGAPZαA-IpaC重组菌菌体沉淀和表达上清中均没有检测到目的蛋白，而在pGAPZαA-IpaC#重组菌菌体沉淀中检测到目的蛋白大小约为70 ku，这进一步验证了毕赤酵母真核表达系统与外源基因本身有关[19-20]。而在pGAPZαA-IpaC#重组菌表达培养基上清中并未检测到目的蛋白，有可能是因为IpaC蛋白本身具有膜结合区，在分泌过程中与酵母细胞发生结合，也有可能是α信号肽与IpaC基因在一定程度上不匹配，为后期进一步研究IpaC蛋白在毕赤酵母中的高效表达奠定基础。在后续试验中，更换信号肽序列或者优化信号肽序列密码子可能使IpaC蛋白高效分泌表达。

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