AK000953基因沉默联合达那唑对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡的影响*

牛力春,李世梅,于 赟,张 颖,梁 静,刘会玲

解放军第三二三医院妇产科(西安710054)

AK000953基因沉默联合达那唑对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡的影响*

牛力春,李世梅△,于 赟,张 颖,梁 静,刘会玲

解放军第三二三医院妇产科(西安710054)

目的：探讨AK000953基因沉默联合达那唑对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡的影响。方法：利用小干扰RNA(RNAi)技术合成AK000953 siRNA,脂质体法转染子宫肌瘤细胞,分别用MTT法、流式细胞术检测AK000953 siRNA联合达那唑对子宫肌瘤细胞的增殖、凋亡的影响。结果：MTT法结果表明达那唑组对子宫肌瘤细胞的抑制率为(17±4.5)%,而AK000953 siRNA+达那唑组对子宫肌瘤细胞的抑制率升高为(56±8.7)%(P<0.01)；流式细胞术检测细胞凋亡结果显示AK000953 siRNA+达那唑组凋亡率显著高于对照组[(43.2±2.3)%与(5±0.4)%,P<0.01]和达那唑组[(43.2±4.3)%与(16.0±2.1)%P<0.01]。结论：AK000953 siRNA可显著增强达那唑对子宫肌瘤细胞的增殖抑制和促进细胞凋亡的效应。

子宫肌瘤是妇女常见的生殖系统良性肿瘤，近年来子宫肌瘤发病率逐年上升，是切除子宫的主要原因之一[1]。前期工作中,我们采用基因芯片高通量筛选获得子宫肌瘤组织和正常子宫平滑肌组织之间表达显著差异的基因AK000953,差异倍数为2.398～12.071倍,提示AK000953基因可能是子宫肌瘤发生发展过程中的关键因子[2]。为进一步探讨AK000953基因对子宫肌瘤是否具有治疗效果，本课题采用RNAi技术靶向沉默AK000953，研究其联合达那唑对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡的影响,从而为子宫肌瘤的分子靶向治疗提供实验依据。

材料与方法

1 材 料 DMEM(Hylone公司，美国),胎牛血清(Gibco公司,美国),I型胶原酶(Gibco公司,美国),胰蛋白酶(Gibco公司,美国),肌动蛋白(α-actin)一抗(Santa公司,美国)。收集解放军第三二三医院妇产科行子宫肌瘤剔除术患者术中肌瘤组织,分离、原代培养获得子宫肌瘤细胞。子宫肌瘤患者纳入标准为子宫肌瘤体积>5 cm×5 cm×5 cm,术前未接受药物治疗,术后病理诊断确诊为子宫平滑肌瘤。

2 研究方法

2.1 子宫肌瘤细胞的原代培养：无菌条件下将子宫肌瘤组织用DMEM培养基冲洗3遍,剪碎至<1 mm的小块，分别加入0.25% I型胶原酶和10 %胎牛血清，37 ℃恒温水浴摇床消化子宫肌瘤组织1.5～2 h,6000 r/min离心3 min 2次,弃上清。重复加入0.25% I型胶原酶和10%小牛血清，继续消化30 min，离心后弃上清，收集细胞。台盼蓝染色观察细胞活性并记数,分别以每毫升培养液含1×105个细胞接种于50 ml培养瓶,置于温度为37℃、5% CO2湿度为95%培养箱中培养,培养基为含20%FBS的DMEM。24 h后倒去未贴壁细胞,继续培养。

2.2 免疫组化法鉴定子宫肌瘤细胞：3～5 d细胞融合达80%～90%时应用免疫组化法鉴定。将无菌盖玻片置于6孔板中,每孔加入1×105个细胞,常规细胞培养,待细胞融合至70%左右时取出盖玻片,PBS轻柔冲洗细胞面,4%多聚甲醛固定15 min。3% H2O2室温孵育5～10 min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5 min 2遍。10%正常山羊血清封闭,室温孵育10 min，去血清。滴加肌动蛋白(α-actin)一抗，4 ℃孵育过夜。PBS冲洗后滴加生物素标记二抗，37 ℃孵育10～30 min。PBS冲洗后滴加碱性磷酸酶标记的链霉卵白素工作液，37 ℃孵育30 min。DAB显色剂显色5 min。苏木精复染、脱水、透明、封片。空白对照以PBS代替一抗。显微镜下观察肌动蛋白(α-actin)阳性被染成棕黄色为子宫肌瘤细胞。阳性细胞超过95%以上鉴定为子宫肌瘤细胞。

2.3 siRNA转染：在http://sidirect2.rnai.jp/ 在线设计siRNA模板序列,经过前期PCR验证,选择沉默效率超过80%的AK000953引物。上游：5‘-AUUAUAAAGAUUAUUGAUGUG-3’,下游：3‘-CAUCAAUAAUCUUUAUAAUAC-5’。接种2×105个细胞/孔于6孔板中,待其达到70%细胞融合后进行转染。使用脂质体 Lipofectamine 2000(Invitrogen,美国)进行转染,具体转染步骤按照Lipofectamine 2000说明书进行。

2.4 MTT法检测AK000953 siRNA联合达那唑对子宫肌瘤细胞增殖能力的影响：常规细胞培养,每孔加入1×105个细胞,待细胞融合至70%左右将细胞分为如下三组：①空白对照组,用生理盐水处理；②达那唑组,用达那唑(1 μg/ml)处理；③AK000953 siRNA+达那唑组(达那唑+siRNA组)：AK000953 siRNA转染24 h后加入1 μg/ml达那唑。各组细胞处理48 h后常规胰酶消化细胞,离心收集各组细胞,调整细胞浓度,以2×103/孔接种于96孔板，每组设5个复孔,常规培养细胞24 h后每孔加 1 mg/ml MTT(Sigma)溶液50 μl,37 ℃静置。作用4 h,弃上清,每孔加入DMSO 150 μl振荡溶解15 min,96孔酶标仪SpectraMAXM5(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)上测定波长为570 nm的吸光度(A)。 抑制率=1-处理组OD/空白对照组OD

2.5 流式细胞术检测AK000953 siRNA联合达那唑对子宫肌瘤细胞凋亡的影响：培养48 h后收集各组细胞,1000 r/min离心5 min,PBS洗涤两次,弃上清,细胞浓度大约每毫升1×106；加入凯基试剂盒中的bindingbuffer 500 μl重悬细胞；加入5 μl AnnexinV-FITC混匀后,加入10 μl Propidium Iodide(PI),混匀；室温、避光、冰浴15 min，在1 h内上流式细胞仪检测细胞凋亡。

结 果

1 子宫肌瘤细胞分离培养及鉴定 在接种消化分离过的细胞大约2 d左右,大部分细胞贴壁,3 d后细胞完全伸展，伸出较长突起呈长梭形,细胞成束平行排列(图1A)。免疫组化结果显示,超过95%细胞胞质内可见α-actin被染成棕黄色,呈丝状结构,为肌瘤细胞,传代后细胞增殖能力旺盛,性能稳定(图1B)。

A：光镜下肌瘤细胞生长形态；B：免疫组化desmin染色的肌瘤细胞

2 达那唑+siRNA对子宫肌瘤细胞增殖能力的影响 见图2。MTT法分别检测空白对照组、达那唑组和达那唑+siRNA组三组细胞增殖能力的变化，结果表明和空白对照组相比, 达那唑组对子宫肌瘤细胞的抑制率仅为(17±4.5)%，而达那唑+siRNA组对子宫肌瘤细胞的抑制率显著升高为(56±8.7)%,两组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。

图2 达那唑+siRNA对子宫肌瘤细胞增殖能力的影响

3 达那唑+siRNA对子宫肌瘤细胞凋亡的影响 见图3。流式细胞术检测各组细胞中细胞凋亡情况，结果显示空白对照组细胞凋亡率仅为(5±0.4)%，达那唑组细胞凋亡率为(16±2.1)%，达那唑+siRNA组细胞凋亡率则达到(43.2±4.3)%。达那唑+siRNA组凋亡率显著高于对照组[(43.2±2.3)%与(5±0.4)%，P<0.01]和达那唑组[(43.2±2.3)%与(16.0±2.1)%,P<0.01]。

A:对照组;B:达那唑组;C:达那唑+siRNA组

图3 达那唑+siRNA对子宫肌瘤细胞凋亡的影响

讨 论

子宫肌瘤的发病机制可能与遗传倾向、性激素及局部微环境等导致子宫平滑肌细胞异常增生,其中雌激素的影响是子宫肌瘤发病的主要因素[3]。达那唑是人工合成的 17-α-乙炔睾酮衍生物，可通过阻断下丘脑促性腺激素释放激素( GnRH) 和垂体促性腺激素(GTH)的释放,从而抑制卵巢雌孕激素的合成，是传统治疗子宫肌瘤及控制症状的有效药物，但长期口服达那唑治疗可产生体重增加、肝肾功能损害、潮热、焦虑等副作用[4]，而达那唑减量治疗子宫肌瘤,又影响了疗效[5]。达那唑可抑制卵巢甾体激素合成,或竞争性与雌孕激素受体结合,导致不排卵及闭经,致使卵巢功能暂时衰退，因而限制了其临床应用[6]。如能发现子宫肌瘤有效的靶向性药物对于改善子宫肌瘤患者生活质量,提高临床治疗疗效具有重要意义。

前期工作中，我们采用基因芯片高通量筛选获得子宫肌瘤组织和正常子宫平滑肌组织之间表达显著差异的基因AK000953，差异倍数为2.398～12.071倍,提示AK000953作为一种与蛋白翻译表达相关的基因在子宫肌瘤呈现高表达,可能参与子宫肌瘤细胞的增殖,促进子宫肌瘤的发生发展,可能是子宫肌瘤发生发展过程中的关键因子[2]。AK000953是与蛋白翻译合成相关的基因,目前AK000953相关报道较少，其功能及生物学效应尚不清楚。siRNA可介导哺乳动物细胞特异性基因沉默,具有高效性和特异性,系基因功能研究和肿瘤基因治疗的新技术[7]。为进一步探讨AK000953基因对子宫肌瘤是否具有治疗效果，本课题以原代培养的子宫肌瘤细胞为研究对象，采用RNAi技术沉默AK000953基因表达,研究AK000953 siRNA联合达那唑对子宫肌瘤细胞增殖、凋亡的影响。MTT结果表明AK000953 siRNA+达那唑可显著增强对子宫肌瘤细胞的抑制效应。流式细胞术结果显示AK000953 siRNA+达那唑凋亡率显著高于对照组和达那唑组。上述实验结果均提示，AK000953 siRNA可显著促进达那唑对子宫肌瘤细胞的细胞毒性，可能是子宫肌瘤分子靶向治疗的良好候选靶点。

综上所述,本研究以原代培养的子宫肌瘤细胞为研究对象,用MTT法和流式细胞术均证实siRNA靶向沉默AK000953表达后能有效增强达那唑对肌瘤细胞的杀伤作用,提示AK000953有可能成为子宫肌瘤的治疗靶点。

[1] 胡 颖,黄能慧,沈祥春,等. 妇科再造丸对雌、孕激素负荷诱导实验性大鼠子宫肌瘤的实验研究[J].陕西中医,2009,30(3)：352-354.

[2] 李世梅,吴水泉,潘建军,等.应用基因芯片技术检测子宫肌瘤的基因表达谱[J].现代妇产科进展,2002,11(5)：346-348.

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[4] Sankaran S,Manyonda IT.Medical management of fibroids[J].Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol ,2008,22(4)：655-676.

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(收稿：2016-08-01)

*兰州军区医药卫生资助课题(CLZ12GA23)

子宫 肌瘤 达那唑 RNA,小分子干扰 细胞增殖 细胞凋亡 @AK000953基因

R737.33

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2017.02.005

△通讯作者