辣椒突变体库的构建及突变群体表型变异分析

周书栋，杨博智，欧立军，刘周斌，吕俊恒，马艳青*，邹学校

(1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省农业科学院蔬菜研究所，湖南 长沙 410125；3.湖南大学隆平分院，湖南 长沙 410008)

辣椒突变体库的构建及突变群体表型变异分析

周书栋1,2，杨博智2，欧立军2，刘周斌3，吕俊恒3，马艳青2*，邹学校2

(1.湖南农业大学园艺园林学院，湖南 长沙 410128；2.湖南省农业科学院蔬菜研究所，湖南 长沙 410125；3.湖南大学隆平分院，湖南 长沙 410008)

选用辣椒自交系‘6421’作为构建突变体库的试验材料，分析甲基磺酸乙酯(EMS)处理对辣椒种子萌发和幼苗生理特性的影响，确定适宜的EMS诱变浓度，在此基础上构建辣椒突变体库，并对突变体库中突变群体的表型变异进行分析。结果表明：EMS质量分数为1.0%时，辣椒种子发芽率和幼苗成活率分别为41.01%和49.32%，接近半致死剂量，且该浓度下辣椒幼苗中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性均达最大值，分别为246.45 U/g、33.99 U/g和158.10 U/(g·min)，丙二醛(MDA)含量为对照的1.85倍；初步构建了含有562个家系辣椒突变体库，突变类型可归纳为叶、茎秆、果实、育性、生育期等5个类别，突变植株数分别占总突变植株数的12.73%、21.56%、6.92%、45.33%和13.46%。

辣椒；甲基磺酸乙酯；半致死剂量；突变体库

辣椒(Capsicum annuum L.)是一种重要的蔬菜作物，适应性强，栽培区域广泛，营养丰富，深受人们的喜爱。据统计，近年来中国辣椒产业发展迅速，辣椒种植面积基本稳定在150 ~ 200万hm2，居蔬菜种植面积首位[1]。辣椒以自交为主，繁殖系数大，杂种优势普遍存在，育种上常采用杂交育种的方式选育新品种，但由于常规杂交育种仅能进行基因间的重组，缺少新基因的参与，使得辣椒遗传背景较狭窄。采用诱变处理方法构建辣椒突变体库，可在原有遗传背景基本不变的情况下改变辣椒染色体或基因结构，使之出现新的性状，在短时间内获得大量的变异材料，是创制辣椒新资源、新品种和开展遗传研究的有效途径。

甲基磺酸乙酯(EMS)是当今使用效果较好的化学诱变剂，具有操作简便、突变频率高、染色体畸变少、易于筛选等优点[2]，现已成功地应用于拟南芥[3]、水稻[4]、玉米[5]、高粱[6]、大豆[7]、番茄[8]等多种作物的诱变育种，在候选基因功能分析等方面发挥了重要作用。已有不少研究者采用EMS诱变处理辣椒种子获得了突变体植株，但其研究内容主要集中于优化EMS诱导浓度以及对M1或M2群体表型进行观察，目前尚少有成功构建辣椒突变体库的报道[9–12]。

本研究中以中国辣椒核心种质资源‘6421’为材料，通过分析不同浓度的EMS处理对辣椒种子萌发及幼苗生理指标的影响，确定适宜的诱变方案，并构建突变体库，同时按照突变群体的表型变异特点进行分类统计，旨在为辣椒功能基因组学研究和辣椒新种质资源创制与新品种选育提供材料。

1 材料与方法

1.1 材料

供试辣椒种子‘6421’，由湖南省农业科学院蔬菜研究所提供；EMS诱变剂由美国Sigma公司生产，用pH 7.0的磷酸缓冲液稀释配制；其余试剂均购自国药集团化学试剂有限公司。

1.2 方法

1.2.1 EMS诱变处理种子

选取饱满辣椒种子1 000粒，分成5组，每组200粒，室温下浸种12 h后，将种子分别浸入质量分数为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%和1.4%的EMS溶液中4 h，整个过程于小摇床上进行。处理完毕后弃去EMS溶液，流水下冲洗种子4 h，彻底去除残留的 EMS溶液，将处理后的种子用吸水纸吸去表面水分。用5%的Na2S2O3溶液处理EMS废液以及试验过程中所用的器皿。以蒸馏水浸泡的种子为对照。试验重复3次。

1.2.2 EMS诱变处理对种子萌发的影响

将诱变处理后的种子和对照种子放入铺有滤纸的培养皿内，(28±1) ℃黑暗培养，适时补水，第14 天测定各处理的种子发芽率(种子发芽粒数与供试种子数的百分比)[11]。将诱变处理后的种子和对照种子播种于72孔塑料穴盘中，30 d后统计幼苗成活率(成活幼苗数与供试种子数的百分比)。试验重复3次。

1.2.3 EMS诱变处理对辣椒幼苗活力的影响

待幼苗生长至4叶1心时，随机采取各处理植株上的真叶，参照李合生[13]的方法对叶片中超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)活性以及丙二醛(MDA)含量进行测定。SOD活性测定采用氮蓝四唑法；POD活性测定采用愈创木酚法；CAT活力测定采用紫外吸收法；MDA含量测定采用硫代巴比妥酸法。试验重复3次。

1.2.4 突变体库的构建

播种10 000粒经半致死浓度处理后的辣椒种子和200粒对照种子至塑料大棚中，单株自交留种后收种。每个单株所收获的种子为1个家系，即M1家系；随机选取500个M1家系，每个家系种植15株辣椒。植株生长期间，观察对照植株和突变群体生长情况，筛选突变体，并按株系收获 M2种子。对于未观察到突变的株系不予保留。播种 M2代突变株系种子至大棚中，每个家系种植 10株，对突变性状能够稳定遗传的突变体进行单株留种，得M3代群体。继续播种M3代突变株系种子，单株收种能稳定遗传的 M4代突变体。将种子保存于湖南省农业科学院蔬菜研究所种质资源库中，按照突变群体的表型变异特点进行分类、统计。

1.2.5 数据分析

采用Excel 2003进行均值和标准偏差的计算；采用SPSS 13.0软件进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 EMS处理对辣椒种子萌发和辣椒幼苗活力的影响

由表1可知，辣椒种子发芽率和幼苗成活率均随 EMS质量分数的增大而呈下降的趋势，表明EMS处理抑制了辣椒种子的发芽和出苗。EMS质量分数为0.2%~0.6%时，辣椒种子处理组和对照组之间的发芽率和幼苗成活率差异不显著，但当浓度进一步升高时，种子发芽率和幼苗成活率均显著下降。EMS质量分数为1.0%时，种子发芽率和幼苗成活率分别为41.01%和49.32%，接近半致死剂量。

表1 EMS处理下辣椒种子的萌发效果和幼苗的主要生理指标Table 1 EMS treatment on seeds germination and some biochemical indexes of seedlings with EMS treatment

随着EMS质量分数的增加，抗氧化物酶SOD、POD和CAT酶活性先升高后降低，而MAD含量一直表现为增加的趋势。EMS质量分数为1.0%时，SOD、POD和 CAT活性均达到最大值，分别为246.45 U/g、33.99 U/g和158.10 U/(g·min)，与对照相比，增幅分别为50.62%、72.45%和100.53%。当EMS质量分数增加至1.4%时，3种酶的酶活性均下降至与对照植株无显著差异的水平。EMS质量分数为1.0%时，MDA含量为对照的1.85倍，当EMS质量分数增至1.4%时，MDA积累达40.46 nmol/mg，为对照的1.97倍。

综合分析不同质量分数的EMS诱变处理对种子萌发和幼苗生理指标的影响，选择1.0%作为建立辣椒突变体库的适宜处理质量分数。

2.2 突变体库的构建

由表2可知，播种10 000粒辣椒种子，获M1代植株4 750株，获M2代突变株系604株；从M2群体中筛选的突变株系到第3代有部分被淘汰，获M3代突变株系562株；M3代种植以后材料没有被淘汰的可直接入库保存，共保存562份M4代突变体种子于种质资源库中。对于收不到种子的突变体，采用突变体与对照株正反交的方式以杂合体形式保存这些突变性状。

表2 EMS诱变‘6421’突变体的筛选结果Table 2 Results of screening of mutants induced from ‘6421’ by EMS

‘6421’突变体库反映了丰富的遗传变异，突变类型可归纳为叶、茎秆、果实、育性和生育期等 5大类，分别占整个突变群体的 12.73%、21.56%、6.92%、45.33%和13.46%。

2.3 突变体库变异性状描述

对照植株‘6421’叶片呈浅绿色，株高约70 cm，开展度约为70 cm，果实呈扁圆牛角形，果长约14 cm，青果呈绿色，成熟果呈鲜红色(图1–1、图1–2)。

叶色突变包括顶芽叶片黄化(图1–3)、叶色浅绿(图1–4)、叶色深绿(图1–5、图1–9、图1–15、图1–16)、叶边缘黄化(图1–6)、叶面出现斑点(图1–7)等 6种类型；叶形突变包括叶片变窄(图1–8、图1–9)、变宽(图1–10、图1–17)、半卷曲(图1–8)或全部卷曲(图1–9)、叶柄变长(图1–10)、叶片皱缩(图1–11)等；叶脉突变表现为叶脉纹路较对照相比更为清晰、明显(图1–12)。

茎秆突变性状包括株高突变、主茎退化、株型突变和茎匍匐生长等变异。株高突变又可分为矮秆突变(图1–5、图1–10、图1–11、 图1–13)和高秆突变(图1–14、图1–15)；主茎退化突变表现为矮秆、叶片丛生，叶柄变长，无花蕾产生，不能正常结果等特征(图1–10)；株型紧凑突变表现为植株在第一次分叉前，控制了侧枝发育的程度，植株分叉角度小，侧枝数多且直立向上(图1–16)；自封顶突变表现为植株生长至5级分叉时即停止生长(图1–17)；茎匍匐生长突变表现为植株苗期主茎弯曲生长，随着植株的发育主茎及各级侧枝也均匍匐生长(图1–18)。

图1 辣椒部分单株叶片性状和茎秆性状突变Fig.1 Leaf and stem mutation of parts of individuals of in pepper

果实突变包括果色、果长、果宽、果形和果柄长度等变异。果色突变包括突变体青果黄色突变(图2–1)、成熟果橙色突变(图2–2)；果长突变表现为与对照植株果实相比，果实长度变长(图 2–3)或变短(图2–4、图2–5、图2–6)；果宽突变表现为与对照植株果实相比，果实宽度变宽(图 2–4)或变窄(图2–5)；果形突变表现为突变体果实呈长线形(图2–3)、锥形(图2–4、图2–5)；果柄突变表现为果柄变长(图2–6)。

图2 辣椒部分单株果实性状和育性性状突变Fig.2 Fruit and fertility mutation of parts of individuals of in pepper

育性突变包括整个花器、花瓣、花药、子房、柱头等发生变异。花器突变表现为花瓣退化，花药畸形、干瘪、无花粉，子房退化，自交不能正常坐果(图2–7)；花瓣突变表现为花瓣畸形，但自交能正常坐果(图 2–8)；花药突变包括花药颜色突变成黄色、花瓣开展度大(图2–9)和花药畸形(图2–11、 图2–12)，自交均不能正常坐果；子房突变表现为花瓣和花药均畸形、多子房，自交不能正常坐果(图2–10)。

生育期突变分为2种：一是早熟突变体出现早花性状，植株现蕾期提前10~15 d，红果期提前8~15 d，结实率与对照植株无差异；二是迟熟突变株中现蕾期延迟12~18 d，红果期延迟10~15 d，与对照植株相比，结实率低10%~15%。

3 结论与讨论

采用EMS诱变构建规模化的突变体库时，除了要求突变丰富外，还需要获得足够数量的可用于进一步研究的突变后代。处理过程中诱变剂浓度的确定是成功构建突变体库的重要指标。大量研究表明半致死剂量可作为筛选突变体的重要指标[14–17]。同时，由于在植物对膜脂过氧化的酶促防御系统中，SOD、POD和CAT等作为重要的保护酶，可防御氧自由基对细胞膜系统的伤害和反映植物抗逆性的强弱，MDA作为膜脂过氧化作用的最终产物，能够在一定程度上反映有害物质的积累，故突变群体苗期抗氧化物酶的活性表达和MDA积累也可作为筛选 EMS诱变浓度的重要指标[18–19]。本试验采用质量分数为 1.0%的 EMS室温处理辣椒‘6421’种子，种子发芽率和幼苗成活率均接近半致死。该结果与前人研究的结果[20–21]存在差异，这意味着EMS处理浓度与试验材料密切相关。不同品种的辣椒所需的EMS质量分数不同，故在构建辣椒突变体库时，首先应针对所选取的试验材料确定好合适的EMS处理浓度。M1群体幼苗中SOD、POD和CAT活性随着EMS质量分数的增加呈现出先升高后降低的趋势，MDA含量一直表现为增加的趋势，经1.0% EMS处理后种子幼苗的3种酶活力均达到最大值，MDA含量为对照的1.85倍，说明该浓度处理下突变群体幼苗期的抵抗逆境胁迫能力最强，生理状态处于最佳时期。综合考虑，可将EMS 1.0%作为建立辣椒突变体库的适宜处理质量分数。

采用半致死剂量的 EMS处理辣椒‘6421’种子构建突变体库，在进行突变体筛选时发现，M1代群体为隐性突变，表型不明显，故在 M1代中只进行突变体的鉴定，而不加以选择。M2代有大量突变性状表达出来，可作为选择突变体的关键时期。有些株系在M3代还会出现分离，至M4代时所获得的突变株系几乎全部能稳定遗传，与前人的研究结果基本一致[5,22–23]；因此，构建突变体库应选择M3代以上的材料进行保存。本试验所构建的突变体库变异类型丰富，可归纳为叶、茎秆、果实、育性、生育期等5个类别，这些与前人所观察到的突变类别基本类似，但每个突变类别中的突变性状较前人观察到的性状更为丰富[9–14]，如本试验中筛选到了主茎退化、茎匍匐生长及果柄变长等突变类型。突变体库的构建为辣椒功能基因组学研究及新品种的选育打下了基础。

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责任编辑：尹小红

英文编辑：梁 和

Construction of mutant library and research on phenotypic variation of mutant population in the pepper(Capsicum annuum L.)

ZHOU Shudong1,2, YANG Bozhi2, OU Lijun2, LIU Zhoubin3, LÜ Junheng3, MA Yanqing2*, ZOU Xuexiao2
(1.College of Horticulture and Landscape, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2.Vegetable Institution, Hunan Academy of Agricultural Science, Changsha 410125, China; 3.Longping Branch, Hunan University, Changsha 410008, China)

In this study, the inbred line ‘6421’ was selected and treated with different concentrations of mutagen (ethyl methane sulfonate(EMS)) to study the effect of EMS treatments on seeds germination and some biochemical characteristics of seedlings, to construct mutant library and analyze the phenotypic traits.The results showed that treated with 1.0% EMS, the germination rate and seedling survival rate were 41.01% and 49.32%, respectively, which were close to those with LD50, the seedlings had the highest enzyme activities of SOD (246.45 U/g), POD (33.99 U/g) and CAT (158.10 U/(g·min)), and the MDA content of seedlings was 1.85 times as much as the control.562 mutant lines were identified and classified into five categories: leaf, stem, fruit, fertility and growth period mutations, which were accounting for 12.73%, 21.56%, 6.92%, 45.33% and 13.46% of the total mutation respectively.

Capsicum annuum L.; ethyl methane sulfonate(EMS); half–lethal dose(LD50); mutant population

S641.3

：A

：1007-1032(2017)01-0031-06

2016–04–18

2016–12–05

湖南省自然科学基金项目(2016JJ2076)；农业部产业技术体系项目(CARS–25–A–8)

周书栋(1982—)，男，湖南株洲人，硕士研究生，主要从事辣椒新品种选育研究，yangy_1223@163.com；*通信作者，马艳青，博士，研究员，主要从事辣椒新品种选育研究，yanqingmahn@163.com