合成环瓜氨酸化蛋白短肽的免疫原性和致关节炎性研究①

陈恩生 崔明珠 赵晓峰 余焙佳 肖长虹 顾为望

(南方医科大学中西医结合医院，广州510515)

合成环瓜氨酸化蛋白短肽的免疫原性和致关节炎性研究①

陈恩生②③崔明珠②赵晓峰 余焙佳②肖长虹②顾为望③

(南方医科大学中西医结合医院，广州510515)

目的：构建环瓜氨酸化蛋白短肽诱导性小鼠关节炎模型,探讨该短肽的免疫原性、致关节炎性。方法：36只DBA/1小鼠随机分为3组，于第0天、第21天分别以Ⅱ型胶原(CⅡ，CIA)、环瓜氨酸化波形蛋白短肽(CCit-Vim，CCV-IA)和偶联血蓝蛋白(KLH)的环瓜氨酸化波形蛋白短肽(CCit-Vim+KLH，CCV+K-IA)皮下注射。ELISA检测血清抗CⅡ抗体、抗CCit-Vim抗体、抗CCP抗体及TNF-α,间接免疫荧光法(IIF)检测抗大鼠食管角蛋白抗体(AKA),对关节炎指数(AI)、足容积、踝关节病理学进行评价。结果：CCV+K-IA小鼠关节炎发病率为25%(3/12)，但关节炎出现时间晚，持续时间短，发病率及关节炎程度均低于CIA；CCV-IA无关节炎发生。CCV+K-IA产生抗CCit-Vim抗体高于CIA(P=0.031)，产生抗CCP抗体反而低于CIA(P=0.007)。CCV+K-IA、CCV-IA产生的抗CⅡ抗体水平均低于CIA(P<0.05)。CCV+K-IA与CIA的TNF-α高于CCV-IA(P<0.05)。CCV+K-IA的AKA阳性率高于其余两组(50% vs CCV-IA 25%、CIA 16.67%)。CCV-IA和CCV+K-IA踝关节病理显示轻度滑膜增生，无滑膜血管翳形成及炎性细胞浸润。结论：偶联KLH的CCit-Vim短肽不仅具有强的免疫原性，而且具有致关节炎性；与CⅡ比较，CCit-Vim+KLH能诱导出更高的AKA阳性率。

类风湿关节炎；瓜氨酸化短肽；胶原诱导性关节炎；动物模型

类风湿关节炎(Rheumatoid arthiritis，RA)是一种以全身多关节对称性肿痛为特点的慢性炎症性自身免疫病。近些年来，随着RA发病机制研究的进展，瓜氨酸化蛋白及抗瓜氨酸化蛋白抗体(Anti-citrullinated protein antibody,ACPAs)在RA发病机制各个环节中的作用逐渐被重视，它们在RA的免疫炎症反应启动和维持过程中都能发挥重要作用。一些学者甚至认为瓜氨酸化蛋白就是诱导RA启动炎症反应的靶抗原，并且以瓜氨酸化蛋白为诱导剂成功建立关节炎鼠模型[1-5]。但是由于瓜氨酸化蛋白种类、诱导方式、注射剂量及实验动物遗传背景的不同，这些模型间表现出不尽相同的关节炎特点，而且与人类RA也存在诸多差异。因此，寻找一种合适的瓜氨酸化蛋白或短肽、采用统一的造模方法来研制更接近人类RA病情特点的瓜氨酸化蛋白诱导性RA模型具有重要的实用意义。

早在1998年，Schellekens等[6]便揭示瓜氨酸化丝聚蛋白短肽具有免疫原性，能促进瓜氨酸特异性T淋巴细胞增殖反应及细胞因子的释放；随后他首次合成环瓜氨酸短肽(Cyclic citrullinated peptide,CCP)，揭示CCP比线性形式具有更强的免疫原性，而且能被RA患者血清中的抗CCP抗体识别，首次揭示瓜氨酸化蛋白短肽在RA中的重要意义[7]。随着研究的深入，人们不断发现来源于瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化纤维蛋白的短肽能诱导特异性的T淋巴细胞增殖反应、产生炎症细胞因子，具有抗原性[8，9]。但是，这些瓜氨酸化蛋白短肽是否有致关节炎性，目前国内外尚无系统报道。虽然申洪波[10]于2010年使用合成的CCP短肽抗原(抗原分子结构未说明)与完全弗氏佐剂混合后于SD大鼠双侧足底部进行注射免疫，诱导出产生抗CCP抗体、抗大鼠食管角质蛋白抗体(Anti-Keratin antibodies,AKA)等自身抗体的关节炎模型，但该模型关节炎的发生是否由CCP直接引起尚不能确认，因为从报道的免疫方法及关节炎发病特点来看，似乎更像是一个佐剂诱导性关节炎。

2010年Feitsma等[8]筛选到瓜氨酸化波形蛋白第 26～44位氨基酸序列SSXSYVTTSTXTYSLGSAL的短肽(X为瓜氨酸)具有较强免疫原性，是人类RA ACPAs的候选靶抗原，然而这一短肽究竟是否有致关节炎作用目前尚没有明确结论。为此，我们参照CCP的合成方法[7]合成环状瓜氨酸化波形蛋白短肽(Cyclic citrullinated vimentin,CCit-Vim)，通过免疫DBA/1小鼠来探讨该短肽的免疫原性及诱发关节炎模型的可行性，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 36只雌性DBA/1小鼠，SPF级，8～10周，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供[ SCXK(京)2012-0001]。饲养于南方医科大学东莞松山湖实验动物科技园SPF级小动物房。控制条件为：温度(23±2)℃、湿度(55±2)%，每日光照/黑暗各12 h，自由进食、饮水；饲料由南方医科大学实验动物中心生产提供，更换垫料2次/周。

1.1.2 主要试剂与仪器 鸡Ⅱ型胶原蛋白(Type Ⅱ Collange,CⅡ)、完全/不完全弗氏佐剂(Sigma,美国)，AKA间接免疫荧光(Indirect Immunofluore-scence,IIF)检测试剂盒(欧蒙，德国)，抗CⅡ抗体、抗CCP抗体、TNF-α等ELISA检测试剂盒(上海酶联生物科技有限公司)，单组分TMB显色液(HyClone，美国)；精密匀浆器(PRO200，美国)，酶标仪(Thermo SCIENTIFIC，美国)，生化培养箱(一恒科技有限公司，上海)，足趾容积测量仪(PV-200，成都泰盟软件有限公司)，包埋机(LEICA EG1160，德国)，全自动脱水机(LEICA TP1020，德国)，石蜡轮转切片机(LEICA RM2245，德国),荧光显微镜及成像系统(OLYMPUS BX43)。

1.2 方法

1.2.1 模型制作

1.2.1.1 短肽乳化液制备 4 mg 鸡CⅡ,加入0.1 mol/L乙酸溶液2 ml，4℃搅拌过夜，配制成2 mg/ml 的CⅡ溶液；4 mg CCit-Vim粉末,溶于2 ml 1×PBS中，配成2 mg/ml 的CCit-Vim溶液。在超净台中，使用精密匀浆器分别将2 mg/ml的CⅡ溶液、CCit-Vim溶液与CCit-Vim+KLH溶液2 ml与等体积的完全弗氏佐剂或不完全弗氏佐剂混匀乳化,终浓度为1 mg/ml。乳化条件为冰浴上操作，匀浆器25 000 r/min,2.0 min,暂停2.0 min，反复4次，至形成油包水白色乳液，滴至水中不扩散为好。

1.2.1.2 小鼠分组 36只雌性DBA/1小鼠随机分为3组，每组12只，分别为CⅡ组(CIA)，CCit-Vim组(CCV-IA)和CCit-Vim+KLH组(CCV+K-IA)。各组周龄、体重差异无统计学意义(P>0.05),于SPF级环境条件下适应性饲养1周。

1.2.1.3 造模 三组小鼠均于第0天进行初次免疫及第21天进行强化免疫。免疫前，将小鼠按40 mg/kg予0.3%的戊巴比妥钠溶液腹腔注射麻醉，背部脱毛处理后，于鼠背部及尾根部多点皮下注射乳化剂。初次免疫时，分别注射CⅡ、CCit-Vim和CCit-Vim+KLH乳化液各0.2 ml/只。强化免疫时注射方法、部位同初次注射，剂量各为0.1 ml/只。

1.2.2 模型评价

1.2.2.1 关节炎指数及关节肿胀程度评价 造模前及造模后每周观察小鼠关节红肿情况，并测量小鼠足容积。①计算关节炎指数(Arthritic index,AI)评分。AI的评分标准如下[11]：各足根据关节红肿程度评为0～4分。0分：无关节红肿；1分：踝关节或足趾的轻度红肿；2分：踝关节的中度红肿；3：包括趾关节在内的全足明显红肿；4分：多足明显红肿伴关节变形、功能障碍。每只小鼠的AI评分最高为16分。≥1分为造模成功。②使用专用的小鼠足趾容积测量仪测量小鼠双后足足容积变化。

1.2.2.2 血清学检测 第13周，小鼠麻醉后，摘眼球采血法取血，3 500 r/min离心15 min后获取血清置于-20℃冰箱保存备用。抗CⅡ抗体、抗CCP抗体、TNF-α水平：根据相关抗体的ELISA检测试剂盒说明书进行操作。抗CCit-Vim短肽抗体：ELISA法检测：pH7.4的1×PBS溶解CCit-Vim短肽(等电点5.51)至终浓度20 μg/ml，先用100 μl短肽抗原包被96孔酶标板，采用HRP标记的羊抗鼠通用型二抗，TMB显色，酶标仪读取450nm的OD值。AKA：根据试剂盒说明书操作，IIF检测法定性检测，待测血清5倍稀释,荧光显微镜下观察。

1.2.2.3 病理学检测 获取小鼠后踝关节，常规固定脱钙、脱水和石蜡包埋，切片厚度4 μm，进行HE染色。半定量评分法评价滑膜增生程度,评分标准如下[12]：滑膜增生程度分为0～4分；0分：无滑膜增生；1分：滑膜增生,滑膜成纤维细胞密度低,未能侵犯到皮下组织；2分：滑膜成纤维细胞密度较高，并侵犯到小鼠皮下组织；3分：在2分的基础,滑膜组织内或侵犯区出现纤维化坏死结节；4分：除有3分的表现外,还见到至少一个以上类似生发中心的滑膜细胞簇集区。

2 结果

2.1 各组小鼠的临床表现 如图1 A1～A3所示，CIA小鼠于首次免疫后第4周陆续出现足关节红肿，前后足均发病，以双后足为主，逐渐加重，约第8周红肿达高峰，部分关节出现活动受限，随后逐渐消退；其发病率为100%(12/12)，AI值最高达14分。CCV-IA小鼠在整个观察周期内均未见明显足关节红肿及关节活动受限，其发病率为0(0/12)。而CCV+K-IA小鼠于首次免疫后第5周开始观察到1只小鼠单个后足趾中度红肿，逐渐减轻，持续2周余，后恢复正常；另2只小鼠于第6周才出现轻微的后足跖部红肿，持续至第8周急速加重，以双后足明显红肿为主，伴关节活动受限，随后又快速减轻，约1周后红肿基本消退，其发病率为25%(3/12)，AI值最高8分。其中，AI分析显示，CIA小鼠的AI明显高于其余两组(P<0.05),而CCV+K-IA和CCV-IA组间差异无统计学意义(P=0.543)；双后足关节足容积变化情况分析与AI的统计分析相似(如图2所示)。

图1 三组小鼠的足红肿表现和组织病理学HE染色(×200)Fig.1 Swelling and HE staining of ankle joints of three groups of mice(×200)Note:CIA.A1，B1；CCV-IA.A2，B2;CCV+K-IA.A3，B3.

图2 不同时间点的关节炎指数(A)和双后足足容积(B)变化Fig.2 Changes of AI (A)and volume of double hind paw(B) at different time points in three groups of mice

2.2 血清抗体及TNF-α结果 三组小鼠均产生不同水平的抗CⅡ、抗CCit-Vim短肽抗体以及抗CCP抗体(如图3所示)，这提示经CCit-Vim或CCit-Vim+KLH短肽诱导，即使无临床可见关节炎的小鼠，也存在对短肽产生的免疫应答反应。其中抗CⅡ抗体水平,CCV-IA和CCV+K-IA均明显低于CIA[ (15.73± 2.10)、(16.71 ± 3.03) vs (19.50 ± 2.36) μg/L,P<0.05]提示CCit-Vim与CⅡ可能有共同抗原决定簇。我们检测了2种瓜氨酸化表位特异性抗体水平，一是抗CCit-Vim短肽抗体，CCV+K-IA高于CIA[ (1.32 ± 0.59) vs (0.78 ± 0.27),P=0.031]，但与CCV-IA差异无统计学意义(P=0.157)。二是抗CCP抗体：CCV+K-IA反而明显低于CIA[ (54.73 ± 7.33) vs(64.37 ± 9.91) ng/L,P=0.007]，与CCV-IA抗体水平差异无统计学意义(P=0.119)。这说明CCit-Vim短肽能够诱导小鼠产生免疫应答，产生特异性的抗CCit-Vim抗体，但由于单纯的短肽免疫原性弱，而偶联KLH的短肽免疫原性明显增强，免疫应答增强，产生更高水平特异性抗体(与CIA比较)。同时也提示，CⅡ可能含有CCP抗原决定簇，而CCit-Vim短肽与CCP的抗原性差异较大。

为进一步证实是否产生抗瓜氨酸抗体，我们又采用IIF法观察血清中AKA情况。如图4所示，CCV+K-IA有6份小鼠血清AKA阳性(阳性率50%)，而CCV-IA仅有3份血清阳性(阳性率25%)，CIA仅2份血清阳性(16.67%)。未出意外的是，CCV+K-IA的3只发病小鼠血清AKA均出现阳性，说明CCit-Vim与诱导AKA的丝聚蛋白可能有相似的抗原决定簇。尽管CⅡ能诱导更多的抗CCP抗体产生，但并不能诱导产生更多的AKA，提示AKA与抗CCP抗体针对的靶抗原有差异。

图3 血清抗体和TNF-α水平Fig.3 Levels of serum antibody and TNF-αNote: *.P<0.05 vs CIA;#.P<0.05 vs CCV-IA.

图4 血清AKA(×200)Fig.4 Serum AKA with IIF(×200)Note: A.AKA positive from positive control serum;B.AKA positive from CCV+K-IA；C.AKA negative from CIA;D.The positive rate of AKA in three groups.

血清TNF-α水平在发生关节炎的CCV+K-IV与CIA相当(P=0.276)，而且均高于无关节炎的CCV-IA，差异有统计学意义[ (645.61 ± 35.26)、(618.98 ± 53.32) vs (533.63 ± 79.49) ng/L,P<0.05]。

2.3 关节组织病理学 三组小鼠踝关节HE染色(图1 B1～B3)显示：CIA的小鼠踝关节腔周围滑膜组织明显增生并突入关节腔，滑膜血管翳形成，侵蚀软骨表面或骨膜，增生的滑膜组织侵犯皮下，部分形成纤维硬化灶，伴滑膜内大量的炎性细胞浸润。而CCV-IA和CCV+K-IA小鼠踝关节仅见轻度的滑膜增生向关节腔内生长，滑膜细胞在3～5层间，少数可见侵犯软骨表面，无明显滑膜血管翳形成及炎性细胞浸润。如图5所示,CIA小鼠踝关节在滑膜增生程度上明显高于CCV-IA和CCV+K-IA[ (1.33±0.49)、(1.33±0.65) vs(2.58±1.16),P<0.05],CCV-IA和CCV+K-IA组间差异无统计学意义(P=1.00)。

图5 踝关节滑膜增生评分Fig.5 Score of ankle synovial hyperplasiaNote: *.P<0.05 vs CIA.

3 讨论

本实验偶联KLH的CCV+K-IA有3只小鼠出现关节炎，而单纯短肽的CCV-IA小鼠无关节炎发生，说明偶联短肽抗原性增强，具有致关节炎性。CCV+K-IA的发病率仅为25%，与瓜氨酸化纤维蛋白原诱导的转基因小鼠模型接近(35.5%)[2]，但远低于其余几个瓜氨酸化蛋白诱导性鼠模型及阳性对照组CIA的发病率(100%)[1，3-5]。CCV+K-IA关节炎小鼠以双后足受累关节为主，典型关节炎特征于首次免疫后第8周才出现，而且呈急速加重、快速缓解、持续时间短的特点，这与既往的瓜氨酸化蛋白诱导性鼠模型及CIA的特点不相同。踝关节组织病理学可见滑膜组织缺乏明显的炎性细胞浸润，与瓜氨酸化纤维蛋白原和瓜氨酸化α烯醇酶诱导的转基因鼠模型的病理学特点相似[2，3]，提示该模型的病理过程中应该出现一个发生在我们获取关节病理检查前的短暂的急性炎性细胞浸润过程，足以导致关节炎发生，而又快速消退。这与该组小鼠关节红肿呈急速加重、快速缓解的临床特点也相符合。但其轻度滑膜增生、无明显骨质破坏的病理学特点，与CIA也存在较大差异。

实验显示三组小鼠均产生不同水平的抗CⅡ抗体、抗CCit-Vim短肽抗体、抗CCP抗体，提示CCit-Vim短肽引起了免疫系统的应答反应。有研究表明针对瓜氨酸化蛋白的ACPAs具有致关节炎的作用[13]。本实验CCV+K-IA产生抗CCit-Vim短肽抗体的能力高于CCV-IA和CIA，表明CCit-Vim+KLH偶联肽免疫原性增强，显著增强免疫系统针对短肽中瓜氨酸抗原表位的应答能力，产生较大量的ACPAs足以产生关节炎。针对血清中的抗CCP抗体，却出现与抗CⅡ抗体相似的结果即CCV+K-IA明显低于CIA，提示CⅡ可能含有CCP的抗原决定簇，诱导产生更多的抗CCP抗体，揭示CⅡ与CCP存在较多的同源性。抗CCP抗体识别的靶抗原是来源于瓜氨酸化丝聚蛋白的CCP短肽[7]，而本实验的抗CCit-Vim短肽抗体识别的靶抗原是来源于瓜氨酸化波形蛋白的CCit-Vim；CCV+K-IA与CIA的血清抗CCit-Vim短肽抗体与抗CCP抗体水平的不对应，正好说明它们识别的靶抗原不同，揭示CCit-Vim与CCP同源性相差较远，抗原性差异较大。有趣的是，血清AKA的阳性率，CCV+K-IA明显高于CIA(50% vs 16.67%)，与抗CCit-Vim短肽抗体结果类似，揭示CCit-Vim与诱导AKA的角质蛋白可能有相似的抗原决定簇，抗CCit-Vim短肽抗体与AKA具有更近的同源性。尽管CⅡ能诱导更多的抗CCP抗体产生，但并不能诱导产生更多的AKA，提示AKA与抗CCP抗体针对的瓜氨酸化丝聚蛋白靶抗原依然存在差异。未出意外的是，3只发生关节炎的CCV+K-IA小鼠血清AKA均阳性，这个临床表现与血清学表现相对应正好证明这个关节炎模型的可靠性，提示那些血清AKA阳性而未发生关节炎的小鼠已经对短肽发生特异性免疫应答，如果随着观察周期的延长也可能出现关节炎，当然，这有待进一步的实验研究证实。目前已有许多研究表明多种来源于瓜氨酸化纤维蛋白α、β链、瓜氨酸化波形蛋白、瓜氨酸化丝聚蛋白的短肽能被RA患者血清中的抗瓜氨酸化蛋白短肽抗体特异性识别，这些短肽抗体具有类似同源ACPAs的功能，在RA的诊断及疾病预测上发挥重要作用[14-16]。因此，上述这些结果表明，在RA的临床诊断过程中，特别是对于那些抗CCP抗体阴性的RA患者，多种ACPAs联合检测对提高RA的诊断效能具有重要的意义。

本研究首次以人工合成的环瓜氨酸化波形蛋白短肽为抗原诱导剂研制环瓜氨酸化蛋白短肽诱导性关节炎模型。尽管目前该模型尚达不到我们预期的目标，其关节炎发病特点、免疫学、病理学特征与CIA以及人类RA尚存在诸多差异，但是我们已能确定偶联KLH的环状瓜氨酸化蛋白短肽不仅具有较强免疫原性，而且具有致关节炎性。这对我们接下来如何去提高该模型的发病率、延长关节炎持续时间等方面的研究提供新的方向和思路：①优化瓜氨酸化蛋白短肽结构。短肽虽不具有复杂的三、四级空间结构，但其一级、二级结构同样影响短肽的性能。研究已经证实β转角结构的环状短肽具有更好的诱导免疫应答的性能[7，17]，因此环状短肽合成过程中确保类似β转角结构是研究的一个关键点。另外，适当增加短肽的氨基酸数目以增加短肽的分子量并扩展短肽中更多的瓜氨酸抗原表位，也是确保短肽具有强抗原性的方法之一。②偶联蛋白的选择。KLH是抗体工程最常用的一种偶联蛋白，能增强相关短肽的免疫性。本实验验证了偶联KLH的短肽抗原性增强，并且成功诱导关节炎。③实验动物遗传背景选择。遗传背景对制作RA的实验动物模型至关重要，选择特定遗传背景的实验动物是确保环瓜氨酸化蛋白短肽诱导性关节炎模型成功的关键。

[1] Lundberg K,Nijenhuis S,Vossenaar ER,etal.Citrullinated proteins have increased immunogenicity and arthritogenicity and their presence in arthritic joints correlates with disease severity[J].Arthritis Res Ther,2005,7(3):R458-467.

[2] Hill JA,Bell DA,Brintnell W,etal.Arthritis induced by posttranslationally modified (citrullinated) fibrinogen in DR4-IE transgenic mice[J].J Exp Med,2008,205(4):967-979.

[3] Kinloch AJ,Alzabin S,Brintnell W,etal.Immunization with Porphyromonas gingivalis enolase induces autoimmunity to mammalian α-enolase and arthritis in DR4-IE-transgenic mice[J].Arthritis Rheum,2011,63(12):3818-3823.

[4] Thiele GM,Duryee MJ,Dusad A,etal.Citrullinated mouse collagen administered to DBA/1J mice in the absence of adjuvant initiates arthritis[J].Int Immunopharmacol,2012,13(4):424-431.

[5] Dusad A,Duryee MJ,Shaw AT,etal.Induction of bone loss in DBA/1J mice immunized with citrullinated autologous mouse type II collagen in the absence of adjuvant[J].Immunol Res,2014,58(1):51-60.

[6] Schellekens GA,de Jong BA,van den Hoogen FH,etal.Citrulline is an essential constituent of antigenic determinants recognized by rheumatoid arthritis-specific autoantibodies[J].J Clin Invest,1998,101(1):273-281.

[7] Schellekens GA,Visser H,de Jong BA,etal.The diagnostic properties of rheumatoid arthritis antibodies recognizing a cyclic citrullinated peptide[J].Arthritis Rheum,2000,43(1):155-163.

[8] Feitsma AL,van der Voort EI,Franken KL,etal.Identification of citrullinated vimentin peptides as T cell epitopes in HLA-DR4-positive patients with rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,2010,62(1):117-125.

[9] Perez ML,Gomara MJ,Kasi D,etal.Synthesis of overlapping fibrin citrullinated peptides and their use for diagnosing rheumatoid arthritis[J].Chem Biol Drug Des,2006,68(4):194-200.

[10] 申洪波,白云静，胡荫奇.环境因素对痹证大鼠自身抗体表达的影响[J].中国中医基础医学杂志，2010,16(9)：832-834.

[11] Kim H,Bang J,Chang HW,etal.Anti-inflammatory effect of quetiapine on collagen-induced arthritis of mouse[J].Eur J Pharmacol,2012,678(1-3):55-60.

[12] Muller-Ladner U,Evans CH,Roberts CR,etal.Human IL-IRa gene transfer into human synovial fibroblasts is chondroprotective[J].J Immunol,1997,158(7):3492-3498.

[13] Kim Y,Lee J,Jung H,etal.Development of synthetic anti-cyclic citrullinated peptide antibody and its arthritogenic role[J].Clin Transl Immunol,2015,4(11):e51.

[14] Malakoutikhah M,Gómara MJ,Gómez-Puerta JA,etal.The use of chimeric vimentin citrullinated peptides for the diagnosis of rheumatoid arthritis[J].J Med Chem,2011,54(21):7486-7492.

[15] Brink M,Hansson M,Mathsson L,etal.Multiplex analysis of antibodies against citrullinated peptides in individuals prior to development of rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum,2013,65(4):899-910.

[16] Cornillet M,Ajana S,Ruyssen-Witrand A,etal.Autoantibodies to human citrullinated fibrinogen and their subfamilies to the α36-50Cit and β60-74Cit fibrin peptides similarly predict radiographic damages:a prospective study in the French ESPOIR cohort of very early arthritides[J].Rheumatology (Oxford),2016，8:kew014.

[17] Fischer S,Geyer A.Filaggrin peptides with β-hairpin structure bind rheumatoid arthritis antibodies[J].Angew Chem Int Ed Engl,2014,53(15):3849-3853.

[收稿2016-04-22 修回2016-06-05]

(编辑 张晓舟)

Study on immunogenicity and arthritogenicity of a synthetic cyclic citrullina-ted peptide

CHENEn-Sheng,CUIMing-Zhu,ZHAOXiao-Feng,YUBei-Jia,XIAOChang-Hong，GUWei-Wang.

TCM-IntegratedHospitalofSouthernMedicalUniversity,Guangzhou510515，China

Objective:To establish a synthetic cyclic citrullinated peptide induced arthritis model in mice,explore immunogenicity and arthritogenicity of this peptide.Methods: 36 DBA/1 mice were randomly divided into three groups,which were injected the type Ⅱ collagen(CⅡ,CIA)emulsion,cyclic citrullinated vimentin peptide (CCit-Vim,CCV-IA)emulsion,cyclic citrullinated vimentin peptide conjugated KLH (CCit-Vim+KLH,CCV+K-IA)emulsion on day 0 and 21,respectively.Using arthritis index(AI),paw swelling to evaluate the incidence of arthritis;ELISA tested serum anti-CCit-Vim antibody,anti-CⅡantibody,anti-CCP antibody and TNF-α,IIF detected AKA;Histopathology of the ankle joint was obsearved.Results: There were three mice appeared arthritis in CCV+K-IA,the incidence rate of 25%,but arthritis occurs later time,short duration,and the incidence and extent of arthritis were lower than the CIA.CCV-IA no arthritis performance.CCV+K-IA produce anti-CCit-Vim antibody were significantly higher than those in CIA (1.32±0.59 vs 0.78±0.27,P=0.031).While Anti-CCP antibody of CCV+K-IA were significantly lower than CIA (54.73±7.33 vs 64.37±9.91,P=0.007).The anti-CⅡ antibody in CCV+K-IA and CCV-IA were lower than the CIA(15.73±2.10，16.71±3.03 vs 19.50±2.36,P<0.05).The TNF-α produced by CCV+K-IA and CIA were both significantly higher than the CCV-IA (645.61±35.26，618.98±53.32 vs 533.63±79.49,P<0.05).The AKA positive rate of CCV+K-IA is 50% (6/12),significantly higher than CCV-IA 25% (3/12) and CIA 16.67% (2/12).Histopathology of the ankle showed that the CCV-IA and CCV+K-IA have a mild synovial hyperplasia,no obvious synovial pannus formation and inflammatory cell infiltration.Conclusion: The cyclic citrullinated peptide conjugated KLH not only has stronger immunogenicity but also has arthritogenicity.It induced a higher positive rate of AKA than CⅡ.

Rheumatoid arthiritis；Citrullinated peptide；Collagen induced arthritis；Animal model

10.3969/j.issn.1000-484X.2017.01.005

陈恩生(1983年-)，男，主治医师，主要从事风湿病的临床与基础研究，E-mail:chenensheng1@163.com。

及指导教师：肖长虹(1964年-)，男，博士，教授，主任医师，博士生导师，主要从事风湿病的基础与临床研究及风湿病疾病动物模型研制，E-mail:chnghngxiao@aliyun.com。 顾为望(1956年-)，男，教授，博士生导师，主要从事实验动物培育、人类疾病动物模型制备与比较医学方面的研究，E-mail:guww100@163.com。

R392.9

A

1000-484X(2017)01-0025-06

①本文为广东省科技计划项目(No.2014A030304025)。

②南方医科大学中医药学院，广州510515。

③南方医科大学实验动物中心(比较医学研究所)，广州510515。