表皮碳氢化合物在云杉大墨天牛和云杉小墨天牛鉴定中的应用

王书平, 苏翠翠, 朱雅君, 张 凯, 朱 坚, 叶 军

(1. 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心, 上海 200135; 2. 南京农业大学植物保护学院, 南京 210095; 3. 上海共青森林公园, 上海 200438)

表皮碳氢化合物在云杉大墨天牛和云杉小墨天牛鉴定中的应用

王书平1*, 苏翠翠2, 朱雅君1, 张 凯3, 朱 坚1, 叶 军1

(1. 上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心, 上海 200135; 2. 南京农业大学植物保护学院, 南京 210095; 3. 上海共青森林公园, 上海 200438)

云杉大墨天牛和云杉小墨天牛是进境木材及木质包装中常见的检疫性害虫,由于墨天牛属近缘种之间的幼虫形态相似,形态鉴定资料不完整,对低龄幼虫的鉴定尤其困难。为了鉴定云杉大墨天牛和云杉小墨天牛,本文利用气相色谱-质谱联用仪(GC-MS)对云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼虫的表皮碳氢化合物进行了分析,经NIST数据库检索,并与标准图谱比较,应用色谱峰面积归一法测定各组分及其相对含量。结果表明,云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼虫表皮中的主要碳氢化合物由C24～C44的直链或支链、饱和及不饱和的长链烃类组成。云杉大墨天牛幼虫表皮有9种碳氢化合物,而云杉小墨天牛幼虫表皮有8种碳氢化合物,其中6种碳氢化合物为两种昆虫共有,但在含量上有差异。云杉大墨天牛特有的成分为正二十四烷、正三十六烷、正四十四烷,而云杉小墨天牛特有的成分为2-甲基-二十六烷、9-二十六碳烯。这些特有表皮碳氢化合物可用于近缘种云杉大墨天牛和云杉小墨天牛的分类鉴定。

云杉大墨天牛; 云杉小墨天牛; 表皮碳氢化合物; 气相色谱-质谱联用仪

云杉大墨天牛Monochamusurussovi和云杉小墨天牛M.sutor属于鞘翅目Coleoptera,天牛科Cerambycidae,墨天牛属Monochamus。墨天牛属广泛分布于北美洲、欧洲大部、非洲北部以及亚洲东部等[1]。墨天牛属的多数种类是为害松、杉、柳、桧柏、栎等林木的重要害虫,其中有不少种类是林木病原微生物的媒介昆虫,给林业生产带来毁灭性灾害[1-2]。云杉大墨天牛和云杉小墨天牛是我国进境木材及木质包装中主要的天牛科害虫,墨天牛属非中国种被列入《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。截获的云杉大墨天牛和云杉小墨天牛大部分为幼虫状态。但由于云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼虫形态相似,特征区分不明显,加之形态鉴定资料不全,给这两种天牛低龄幼虫的鉴定带来了很大困难。

昆虫表皮碳氢化合物是昆虫表皮蜡质层的主要成分,是碳原子数为20～50的直链或支链、饱和及不饱和的长链烃类,蜡层和护蜡层经过多元酚鞣化作用后,性质相当稳定[3-4]。Hoppe 等比较了3个虻属Tabanus害虫在形态和地理分布上相似的种表皮碳氢化合物,发现种间差异显著[5]。Harverty等对原白蚁属Zootermopsis群体(包括各个等级)的表皮碳氢化合物进行分析测定,得到了63 个组分。根据各组分的有无、含量及统计分析结果,将原白蚁属群体分为4个独特的碳氢化合物表现型,并对该属现存3个种的划分提出质疑,根据表皮碳氢化合物的种特异性,鉴定出原白蚁属的一个新种[6]。Golebiowski等人分别对丝光绿蝇Luciliasericata幼虫、蛹、雌成虫和雄成虫的表皮碳氢化合物进行了研究,发现在这4种虫态中,均以大量的C27和 C29的正烷烃成分为主,其中幼虫和蛹期以C29为主,含量分别为42.1%和59.5%,成虫期以C27为主,含量分别为雌成虫47.5%,雄成虫47.9%[7]。崔可伦等利用表皮碳氢化合物对淡色库蚊Culexpipienspallens和致倦库蚊C.pipiensquinquefasciatus进行了鉴别,分析了海南省不同地区不同季节大劣按蚊Anophelesdirus的表皮碳氢化合物,表明其为同一个种[8-9]。赵成银等对西花蓟马Frankliniellaoccidentalis成虫和若虫的表皮碳氢化合物主要成分进行了分析,认为西花蓟马成虫和若虫表皮中的主要成分为C25～C29的支链和直链饱和烷烃,成虫和若虫表皮中分别检测到9种和8种碳氢化合物,9-甲基二十五烷为成虫特有,其他8种碳氢化合物为成、若虫共有[10]。

目前,对云杉大墨天牛和云杉小墨天牛表皮碳氢化合物的研究尚未见报道。本文对云杉大墨天牛和云杉小墨天牛表皮碳氢化合物组分进行分析,探索表皮碳氢化合物在墨天牛属幼虫分类鉴定工作中的实际应用意义,积极寻找准确快速的幼虫分类鉴定技术,从生化水平上对昆虫分类研究提供理论依据,为云杉大墨天牛和云杉小墨天牛的种类快速鉴别及其检疫监测提供新的技术手段。

1 材料与方法

1.1 样品来源

供试墨天牛幼虫为5龄幼虫,从来自乌克兰的进境木材中发现,经形态分类鉴定,确定为云杉大墨天牛和云杉小墨天牛。

1.2 仪器与试剂

仪器:气相色谱(安捷伦-7890A)与质谱(安捷伦 5975C)联用仪;冻干机(LABCONCO);氮吹仪(HGC-12A)

试剂:正己烷(国药集团化学试剂有限公司)

1.3 仪器分析条件

色谱柱为HP-5MS石英毛细管柱(0.25 mm×30 m×0.25 μm)(美国Agilent公司),进样口温度为280℃,不分流,色谱柱的起始温度80℃保留1 min,以5℃/min升至200℃,保留2 min,再以10℃/min升至300℃,保留10 min。载气为高纯度氮气,柱压为9.38 psi。采用直接进样的方式,进样体积为1 μL,GC流速为1 mL/min。质谱参数为:四级杆温度为150℃;离子源温度为230℃;扫描速度:每秒5张质谱图。

1.4 样品制备方法

将墨天牛幼虫置于清水中用毛笔清除其表面的杂质、粪便等,随后置于干净的纸上晾干。将晾干的墨天牛幼虫放入干净的EP管内,在-30℃冰箱内预冻存24 h，然后放入冻干机内进行冻干,冻干条件为冷阱温度-40℃,真空度0.01 mbar以下,冻干时间为24 h。将冻干的墨天牛幼虫放入10 mL EP管内,加入5 mL正己烷萃取20 min,吸取上清液至另一个干净的EP管内,使用氮吹仪浓缩上清液至500 μL。将浓缩后的上清液移至色谱瓶中备用。

1.5 数据分析

定性分析：将由气相色谱分离得到的各组分通过质谱仪进行鉴定,组分鉴定分析主要根据各化合物的质谱图所得离子峰信息,首先推断各组分分子量,再按照分子裂分的一般规律及质谱解析程序做初步分析,最后与EPA/NzHMas、Spectral Data标准图谱库中的标准图谱对照确定每个组分的结构式。

定量分析：应用气相色谱仪分析墨天牛表皮碳氢化合物,根据供试虫体的总离子流色谱图,分别对每一组分峰的面积积分,获得相应的各组分峰的面积,(在试验条件恒定时,峰面积或峰高与组分的含量成正比)。根据各组分峰的峰面积,按比例求出其组分的相对含量。

2 结果与分析

2.1 气相色谱-质谱联用(GC-MS)分析总离子流图

对墨天牛幼虫表皮碳氢化合物经GC-MS分析,获得云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼虫表皮碳氢化合物的总离子流色谱图(图1),GC-MS分析共检测到11种碳氢化合物,其中云杉大墨天牛幼虫表皮中检测到9种碳氢化合物,云杉小墨天牛幼虫表皮中检测到8种碳氢化合物。

图1 云杉大墨天牛(a)和云杉小墨天牛(b)幼虫表皮碳氢化合物总离子流图Fig.1 Total ion chromatogram of Monochamus urussovi (a) and M.sutor (b) of the cuticular hydrocarbons

2.2 墨天牛表皮碳氢化合物组分及含量分析

经GC-MS分析和NIST谱库系统检索并与标准图谱比较,获得墨天牛幼虫表皮碳氢化合物的名称和相对含量。云杉大墨天牛幼虫表皮有9种碳氢化合物(表1),包括正二十四烷、正二十五烷、3-乙基-二十四烷、正二十七烷、正三十四烷、三十碳六烯、正二十九烷、正三十六烷、正四十四烷;其中正二十五烷含量较高,为54.51%,其次为正二十七烷,含量为27.16%,正四十四烷含量最低,相对含量为0.51%。云杉小墨天牛幼虫表皮有8种碳氢化合物(表2),包括2-甲基-二十六烷、正二十五烷、3-乙基-二十四烷、9-二十六碳烯、正二十七烷、正三十四烷、三十碳六烯、正二十九烷;其中正二十五烷含量较高,为55.70%,其次为正二十七烷,含量为24.96%,2-甲基-二十六烷含量最低,相对含量为1.11%。

根据试验结果可知,墨天牛的11种碳氢化合物主要是由直链和支链的饱和烷烃和烯烃组成,云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼虫有6种共有的碳氢化合物,占97%～98%。其共有物质的丰度,云杉大墨天牛都高于云杉小墨天牛,其中云杉大墨天牛中特有的成分为正二十四烷、正三十六烷、正四十四烷。其中云杉小墨天牛中特有的成分为2-甲基-二十六烷和9-二十六碳烯。

表1 云杉大墨天牛幼虫表皮碳氢化合物

Table 1 Cuticular hydrocarbons ofMonochamusurussovilarvae

序号No.保留时间/minRetentiontime特征离子m/zofcharacteristicions碳氢化合物Hydrocarbon峰高Peakheight相对含量/%Relativecontent110.644M+338正二十四烷n-tetracosane146090.79212.091M+352正二十五烷n-pentacosane96810654.51313.102-3-乙基-二十四烷3-ethyl-tetracosane990315.05414.882M+380正二十七烷n-heptacosane64138427.16515.884M+478正三十四烷n-tetratriacontane1393065.45616.679-三十碳六烯Squalene435541.70717.69M+408正二十九烷n-nonacosane903344.22818.53M+506正三十六烷n-hexatriacontane191280.62920.119M+618正四十四烷n-tetratetracontane135950.51

表2 云杉小墨天牛幼虫表皮碳氢化合物

Table 2 Cuticular hydrocarbons ofMonochamussutorlarvae

序号No.保留时间/minRetentiontime特征离子m/zofcharacteristicions碳氢化合物Hydrocarbon峰高Peakheight相对含量/%Relativecontent110.651-2-甲基-二十六烷2-methylhexacosane92271.11212.072M+352正二十五烷n-pentacosane50559555.70313.102-3-乙基-二十四烷3-ethyl-tetracosane433604.53414.657-9-二十六碳烯9-hexacosene194101.78514.872M+380正二十七烷n-heptacosane29365224.96615.872M+478正三十四烷n-tetratriacontane550764.63716.673-三十碳六烯Squalene400953.20817.564M+408正二十九烷n-nonacosane537344.08

3 讨论

1969年，Moore首先报道了澳大利亚澳洲土垅白蚁Nasutitermesexitiosus表皮烃的组成，发现其主要为24～27碳的直链烃，且以奇数碳为主[11]。Golden等通过表皮碳氢化合物对萤叶甲科的两个近缘种Diabroticalongicornis与D.barberi进行了分析[12]。Anyanwu和Carlson等根据表皮碳氢化合物中二十六碳烷、1，3，2-三甲基三十一碳烷和二甲基三十九碳烷的相对丰度差异，将冈比亚按蚊复合体Anophelesgambiae中两个形态上无法辨别的近缘种A.gambiae和A.arabiensis进行了区分[13-14]。日本学者Takematsu对4种树白蚁Glyptotermes的研究表明，黑树白蚁G.fuscus、赤树白蚁G.satsumensis和G.nakajimai的表皮碳氢化合物组成各异，而G.kushimensis的表皮碳氢化合物组成与G.nakajimai相同。因此认为G.kushimensis与G.nakajimai应为同一种，即存在同物异名现象[15]。Carlson和Walsh分析了蚋Simuliumdamnosum复合体中的2个种，通过对表皮碳氢化合物组分进行分析，成功地将复合体中两个种鉴定出来[16]。

国内对昆虫表皮碳氢化合物的研究较少。赵彤言等应用毛细管气谱法对我国尖音库蚊复合组尖音库蚊、淡色库蚊和致倦库蚊的表皮碳氢化合物进行了分析，并与该复合组分布于日本的骚扰库蚊以及亲缘种迷走库蚊进行了比较。结果表明，尖音库蚊复合组各成员碳氢化合物的主要组分相同，含量略有差异，与迷走库蚊相比则有显著差异，表现出了复合组的特征[17]。高明媛等研究发现，棉铃虫与烟青虫幼虫表皮碳氢化合物的组分与含量均有显著差异[18]。梁晓松等利用固相萃取技术对台湾白蚁表皮碳氢化合物进行萃取，分析发现白蚁表皮中含有24种碳氢化合物，主要为11，13-二甲基二十六烷烃(33.34%)和2,4,6-三甲基二十七烷烃(15.75%)[19]。

近缘种云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼虫形态上十分相似，很难鉴定。通过GC-MS分析结果表明，云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼虫都含有6种相同的碳氢化合物，但它们也含有自己特有的碳氢化合物。这些特有的碳氢化合物可用于鉴定云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼虫，这为今后墨天牛的检疫鉴定提供了有用的数据支持。云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼虫表皮碳氢化合物成分与相对含量的差异，其原因有待进一步深入研究。利用表皮碳氢化合物区分云杉大墨天牛和云杉小墨天牛幼虫可以大大缩短口岸检疫的时间，且成本低，操作简单，不受实验样品的限制，干燥标本、新鲜标本或冷冻标本都可以进行分析，克服了分子鉴定方法对活体样品的特殊要求，并且整体浸泡的提取方法不损坏昆虫的外部形态，可以继续保存标本，以备将来进一步研究，在口岸检疫中有较高的实用价值。

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(责任编辑:杨明丽)

Identification ofMonochamusurussoviandMonochamussutorby using cuticular hydrocarbons

Wang Shuping1, Su Cuicui2, Zhu Yajun1, Zhang Kai3, Zhu Jian1, Ye Jun1

(1.TechnicalCenterforAnimalPlantandFoodInspectionandQuarantine,ShanghaiEntry-ExitInspectionandQuarantineBureau,Shanghai200135,China; 2.CollegeofPlantProtection,NanjingAgriculturalUniversity,Nanjing210095,China; 3.ShanghaiGongqingForestPark,Shanghai200438,China)

Monochamusspp. are important quarantine pests, which can be found in imported wood and wood packages. The cuticular hydrocarbons from the cuticle ofMonochamusurussoviandM.sutorwere analyzed by gas chromatography and mass spectrometry (GC-MS) without solvent. The composition of the cuticular hydrocarbons was then determined by the area normalizing method. By searching the NIST database and comparison with standard mass spectra, nine constituents were identified in the cuticular hydrocarbons ofM.urussovi, and eight in those ofM.sutor. The principal components ofM.urussoviandM.sutorcuticular hydrocarbons were straight and branched-chain, saturated and unsaturated long-chain hydrocarbons ranging from C24to C44. Similar hydrocarbon patterns were found inM.urussoviandM.sutorand six constituents were found in both pests but with differences in quantity.n-tetracosane,n-hexatriacontane andn-tetratetracontane were detected only inM.urussovi, whereas 2-methylhexacosane and 9-hexacosene were found only inM.sutor.

Monochamusurussovi;Monochamussutor; cuticular hydrocarbon; GC-MS

2016-01-27

2016-02-08

上海出入境检疫检疫局课题(HK006-2014)

S 763

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2017.01.019

* 通信作者 E-mail: wangsp@shciq.gov.cn