电击法诱导细胞融合实验研究

王宏刚， 李 烨， 陈成彬， 王春国， 陈 力， 宋文芹， 白艳玲， 张金红， 刘 方

(南开大学 生物实验教学中心，天津 300071)

电击法诱导细胞融合实验研究

王宏刚， 李 烨， 陈成彬， 王春国， 陈 力， 宋文芹， 白艳玲， 张金红， 刘 方

(南开大学 生物实验教学中心，天津 300071)

分别利用两种不同的荧光染料Dio和DiI对细胞进行标记，使细胞膜可以发出绿色或红色荧光;然后选择合适的条件，使用细胞融合仪诱导2个细胞融合成为1个细胞;最后，通过荧光显微镜观察，成功融合的细胞可以同时观察到红色荧光和绿色荧光。该实验可以帮助学生掌握电击诱导细胞融合的原理和操作方法，培养学生的科研兴趣，提高学生的综合素质。

细胞融合; 电击法; 实验教学; 教学改革

细胞融合技术兴起于20世纪60年代[1],是一种利用特定方法使2个细胞(原生质体)发生膜融合、胞质融合形成双核或多核的杂合细胞的技术,也称为细胞杂交[2]。细胞融合技术广泛应用于生物医药[3]、肿瘤研究[4]、环境微生物学[5]、作物育种[6]等领域。细胞融合的方法有生物法、化学法和物理法3类。目前,在本科实验教学中使用最多的是化学法,通过聚乙二醇(PEG)来诱导细胞融合[7-9]。近些年来,有着效率高、细胞毒性低、操作简单等优点的电击法越来越多地应用在科研中。为了让本科生能够掌握电击法诱导细胞融合的原理与实验方法,我们对如何在本科实验教学中开设电击法诱导细胞融合实验进行了大量的探索,取得了良好的教学效果。

1 实验材料与试剂

实验材料：人宫颈癌细胞HeLa细胞株、人T淋巴细胞白血病细胞Jurkat细胞株

主要试剂：DMEM培养基，1640细胞培养基，小牛血清，双抗，胰蛋白酶，BS缓冲液，甘露醇，MgCl2，CaCl2，Dio，DiI。

2 实验方法

2.1 细胞标记

(1) 选择生长状态良好的贴壁生长细胞,弃去培养基,加入0.25%胰蛋白酶进行消化,使用低速离心机1 000 r/min离心10 min,弃去上清液(如使用悬浮培养的细胞可省略此步骤)。

(2) 加入适量培养基,充分吹打重悬细胞,1 000 r/min离心10 min,弃去上清液。重复2～3次,充分洗净细胞。

(3) 将收获的细胞分为2份,加入适量培养基,2份细胞分别加入5 μL DiI或Dio(5 mmol/L 使用DMSO配制),放入二氧化碳培养箱中继续培养0.5～1 h。

2.2 细胞融合

(1) 将标记好的细胞以1 000 r/min离心10 min,弃去上清液,加入适量电融合缓冲液(0.3 mol/L 甘露醇,0. 1 mmol/L MgCl2,0. 05mmol /L CaCl2)重悬细胞,调整细胞密度为1×105个/mL。

(2) 分别吸取50 μL经过Dio和DiI标记的细胞悬液,充分混合后加入电融合杯中,使用电融合仪选择合适的脉冲类型和电压(如:Hela细胞和Hela细胞融合采用指数衰减波,电压为80 V/mm,Jurkat细胞和Hela细胞融合采用指数衰减波,电压为70 V/mm,)进行细胞融合。

(3) 将融合完成的细胞悬液从电融合瓶中吸出,放入3.5 cm培养皿中,加入1 mL 1 640细胞培养基(培养基类型根据细胞株系类型选择),放入二氧化碳培养箱中培养0.5～1 h。

(4) 取少量细胞悬液,滴在洁净的载玻片上,再加入2 μL含DAPI的防荧光淬灭剂,置荧光显微镜下观察细胞融合的情况。

3 实验结果

在细胞融合之前,一份细胞被Dio标记后发出绿色荧光,另一份细胞被DiI标记后发出红色荧光。细胞融合后,融合成功的细胞会同时发出绿色荧光和红色荧光,经DAPI标记后,细胞核会发出蓝色荧光(见图1和图2)。

图2 Jurkat细胞和Hela细胞融合(显示细胞融合完成)(100×)

4 讨论

4.1 本科教学中采用电击法的优势

(1) 与科研不同,实验教学需要有较高的成功率,电击法的融合效率比较高,可以保证实验结果的阳性率,提高学生的学习兴趣。

(2) 电击诱导法的原理和实验步骤都较为简单,便于本科生学习和操作。同时,通过对电击法的学习可以引导学生举一反三地掌握其他融合方法的实验原理。

(3) 实验的安全性是本科实验教学中必须要考虑的因素,跟其他方法相比,电击法使用的试剂种类较少,且均为实验室常用普通试剂,不存在生物安全、环境污染等方面的安全隐患。

4.2 实验教学过程中的注意事项

(1) 实验使用的细胞状态要好。在本实验中,细胞的状态对细胞融合的效率影响很大。如果学时充裕,可先对学生进行细胞培养相关技能的训练后再开展细胞融合的实验,如果学时有限,可以由教师代为准备实验材料。

(2) 电击的条件要根据不同的细胞类型来进行调整。脉冲类型、电击强度等参数都会对细胞的融合效率造成影响[10-11]。电击过于温和、融合效果不好,电击过于强烈则会造成细胞大量死亡。教学过程中,考虑到本科生并没有足够的实验经验,需要教师提供一个合适的电击条件,或者对电击参数给一个参考范围,由学生自己设计实验进行优化。

5 结语

随着新技术、新方法的不断涌现及在细胞生物学研究领域中的广泛应用,对细胞生物学实验教学进行改革势在必行[12]。本实验在教学思路和实验内容上进行了大胆的改革,在夯实学生基本实验技能的基础上开阔和拓展了其科学研究的视野和方法,帮助学生学习细胞生物学领域的先进技术,为其后续的科研训练课程打下了良好的基础。基于生物基础实验教学在创新教育中的重要作用,我们对教学方法、教学内容等进行了积极的创新,将经典实验方法与现代实验技术相结合,以期通过改革更好地培养学生的创新思维、创新精神和创新能力[13]。南开大学国家级实验教学示范中心的“细胞生物学实验”为南开大学校级精品课程,本实验是一次对精品实验课程建设改革的尝试,对促进实验教学示范中心的建设也起到了良好的示范作用[14]。

References)

[1] 赵志强,郑小林,张思杰,等.细胞融合技术[J].生物学通报,2005,40(10):40-41.

[2] 李乐,张城硕,张佳林. 细胞融合技术及其应用研究进展[J]. 辽宁医学杂志,2013,27(4):195-198.

[3] 孙沛懋.浅析细胞融合技术在生物医药中的应用[J].科技创新与应用,2013(28):28.

[4] 米蕊芳,潘春晓,卞晓翠,等.细胞融合通过PI3K-AKT通路降低黑色素瘤细胞增殖能力[J].基础医学与临床,2012,32(6):682-686.

[5] 任柏林,谢水波,唐振平,等.细胞融合技术及其在构建水处理工程菌中的应用[J].安全与环境学报,2010,10(3):20-24.

[6] 陈洁,刘田田,徐雪平.草莓品种资源和遗传育种研究进展[J].福建农业,2014(9):31-33.

[7] 章静波,黄东阳,方瑾.细胞生物学实验技术[M].北京:化学工业出版社,2011.

[8] 王金发,何炎明,刘兵.细胞生物学实验教程[M].2版.北京:科学出版社,2011.

[9] 王晶珊,王爱华.细胞工程实验教程[M].北京:高等教育出版社,2011.

[10] 张斌,华再东,郑新民,等.猪去核无透明带卵母细胞电融合参数的探讨[J]. 中国畜牧兽医,2014,41(4):206-210.

[11] 黄浅,赖钟雄,赖呈纯,等. 荔枝TPEC 与龙眼EC 的电融合参数研究[J]. 福建农林大学学报(自然科学版),2014,43(4):361-368.

[12] 王宏刚,陈成彬,王春国,等.综合院校“细胞生物学实验”教学改革探索[J].实验技术与管理,2014,31(1):191-193.

[13] 解丽芳,林宏辉.生物基础实验教学中心的创新教育作用[J].实验技术与管理,2016,33(5):168-169,177.

[14] 王金发,王宏斌,刘兵,等.创新“细胞生物学与遗传学实验”精品课程建设 提升生物学实验教学示范中心的示范作用[J].实验技术与管理,2013,30(6):1-5.

Research on experiment of cell fusion induced by electric shock

Wang Honggang, Li Ye, Chen Chengbin, Wang Chunguo, Chen Li, Song Wenqin, Bai Yanling, Zhang Jinhong, Liu Fang

(Biological ExperimentalTeaching Center, Nankai University, Tianjin 300071, China)

By using two different fluorescent dyes of Dio and DiI to mark the cells respectively, the cell membrane can send out green or red fluorescence. Then, by choosing certain proper conditions, the cell fusion apparatus is used to induce the fusion of two cells into one. Finally, with the fluorescence microscope, the red fluorescence and the green fluorescence can be observed at the same time in the fused cells. Through this experiment, it can help the students to master the principles and operation method of the cell fusion induced by electric shock, cultivate the students’ interest in scientific research, and improve their comprehensive quality.

cell fusion; electric shock method; experimental teaching; teaching reform

10.16791/j.cnki.sjg.2017.01.013

2016-07-29

国家基础学科人才培养基金“条件建设项目”(J1310003)；教育部2016年度基础学科拔尖学生培养试验计划研究课题(201612)；南开大学2014年本科一般教学改革项目

王宏刚(1982—),男,山西繁峙,硕士,实验师,从事细胞生物学实验和遗传学实验教学

E-mail：whg820604@nankai.edu.cn

陈成彬(1972—)男,河北冀州,博士,副教授,研究方向为分子细胞遗传学.

E-mail：chencb@nankai.edu.cn,

Q813.2

A

1002-4956(2017)1-0053-03