番茄黄化曲叶病毒抗性检测DNA提取方法的优化及应用

乔 宁 阎振鑫 尼秀梅 代惠洁 竺晓平 孔令广

（1潍坊科技学院，山东寿光 262700；2山东农业大学植物保护学院，山东省蔬菜病虫生物学重点实验室，山东泰安 271018；3山东寿光富康制药有限公司研发部，山东寿光 262700）

番茄黄化曲叶病毒抗性检测DNA提取方法的优化及应用

乔 宁1，2 阎振鑫3 尼秀梅1 代惠洁1，2 竺晓平2* 孔令广2

（1潍坊科技学院，山东寿光 262700；2山东农业大学植物保护学院，山东省蔬菜病虫生物学重点实验室，山东泰安 271018；3山东寿光富康制药有限公司研发部，山东寿光 262700）

通过对传统DNA提取方法进行优化和改进，得到一种快速提取番茄DNA的方法。综合比较改进法、商品化试剂盒（经典法）和其他试剂盒（快速法）提取番茄DNA的效果。结果表明：改进法相比经典法提取的DNA质量稍有差别，但用时较少，完全可以满足后续PCR试验要求，尤其适用于番茄黄化曲叶病毒的大规模抗性检测；同时该法无液氮及其他有毒溶剂的加入，不仅节省了试验时间和试验成本，而且大大降低了试验的危险性。

番茄黄化曲叶病毒；DNA提取；抗性检测

番茄是一种营养价值和经济价值均较高的蔬菜作物，现在已经成为基因工程和分子生物学的重要研究对象。番茄黄化曲叶病毒病（Tomato yellowleaf curl virus，TYLCV）的发生严重制约了世界各地的番茄生产，培育优良抗病品种是防治该病毒最有效和最经济的途径，而番茄抗病材料的筛选及其抗性基因的快速准确鉴定是番茄抗病育种的基础和关键。传统的植物基因组DNA提取方法操作步骤较为繁琐，而且需要加入氯仿等有毒物质，在很大程度上增加了试验难度，减缓了试验进程。因此，在番茄黄化曲叶病毒抗性基因检测过程中，探索一种更为快捷有效的DNA提取方法以利于对其进行一系列的分子生物学研究显得十分重要。

传统DNA提取方法主要有CTAB法（Doyle & Doyle，1987；宋艳波 等，2011；李金璐 等，2013）和SDS法（蔡朝辉 等，2000；Kamiya & Kiguchi，2003；卢东柏 等，2008）。采用这两种方法提取DNA需要进行多次提纯才能够达到后期试验要求，高等植物的细胞中均含有细胞膜、酚类及多糖等物质，这些物质的存在使得DNA提取过程变得繁琐复杂，CTAB法和SDS法都是先溶解细胞，再用氯仿等有机溶剂除去多糖、蛋白质等，最后用异丙醇或乙醇沉淀洗涤DNA获得相应产物；在长期的试验过程中还发现其他一些问题：如进行叶片研磨时，需要使用液氮和体积较大的容器，技术含量较高，所需的试验材料较多、试验时间较长，而获得的DNA数量和质量也受到一定的限制，容易影响后续的PCR检测及试验结果。谢艳等（2001）、Collard等（2007）、程文等（2016）成功运用碱裂解法提取了烟草、水稻、大豆种子等植物的DNA，该方法高效快捷，但是对样品新鲜度和植物种类有较高要求，而且提取的DNA纯度较低，应用范围有一定的局限性。目前用于植物DNA提取的商品化试剂盒，主要借助硅胶膜吸附柱特异性吸附DNA的特点，其原理是在裂解液的作用下使植物细胞发生裂解，暴露出核酸等物质，再用洗柱液把杂质等去除掉，而DNA在高盐浓度下特异性结合于硅胶膜中，洗脱后所得DNA浓度和纯度都较高，适合进行后续的分子生物学试验。磁珠法也是近几年发展起来的一种新型DNA提取方法，该方法高效快速、通用性好，但成本较高，很难大规模推广应用（李正美 等，2013）。

目前，番茄黄化曲叶病毒抗性基因的检测与鉴定仍以PCR技术为主，其中番茄DNA的提取主要是使用商品化的试剂盒或者CTAB法（蒋振 等，2014；田兆丰 等，2014；郑积荣 等，2015）。本试验是在SDS法的基础上，结合硅胶膜吸附柱的优点，得到一种快速提取番茄DNA的方法；并分别以改进法、商品化试剂盒（经典法）和其他试剂盒（快速法）提取的番茄DNA为模板，以TY1-2F/ TY1-2R、SCAR3-F/SCAR3-R为引物进行PCR检测，为大量番茄样品的TYLCV抗性快速鉴定提供理论依据和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2015年8月，在潍坊科技学院潍科种业公司育苗基地的番茄种植棚中随机选取10株潍科粉1号（吕金浮 等，2014）植株，每株从上、中、下部共采集10片新鲜叶片，取其中5片冻存于-40℃冰箱备用；阳性对照为先正达公司的番茄品种齐达利；阴性对照为本实验室保存的番茄品种Moneymaker。

1.2 试验试剂

植物基因组DNA提取盒、2×Taq Master Mix、DNA结合液（Binding Buffer 1）等购自北京全式金生物科技有限公司；硅胶膜吸附柱、一管式植物DNAout等购自北京天恩泽生物科技有限公司。

参 考 Ji等（2007）、Verlaan等（2013）的方法设计引物序列，并由北京华大基因 科技 有 限公 司 合成。TY1-2F（5′-3′）：CGTTCTGCTTAATGTGGCAAT，TY1-2R（5′-3′）：CAACGGAGGGAGCATATCAT；SCAR3-F（5′-3′）：GGTAGTGGAAATGATGCTGCTC，SCAR3-R（5′-3′）：GCTCTGCCTATTGTCCCATATATAACC。

1.3 试验方法

1.3.1 番茄DNA提取 本试验采用3种DNA提取方法。试剂盒法（经典法）：参照植物基因组DNA提取试剂盒说明书进行。改进法：① 采用直径6 mm的打孔器打取番茄叶片，放进2 mL离心管中，加入100 μL DNA提取液Ⅰ（2×）（0.5 mol·L-1NaOH，5 mmol·L-1EDTA，2% SDS，4% PVP），再加入100 μL无菌水，混匀后加入1颗直径6 mm的钢珠，置于高通量组织研磨器中研磨；② 研磨后加入50 μL KAC溶液（3 mol·L-1KAC，5 mol·L-1醋酸）与450 μL DNA结合液混匀，12 000 r·min-1离心60 s；③ 小心吸取上清液200～300 μL，加到硅胶膜吸附柱中，静置1 min，12 000 r·min-1离心30 s；④ 弃废液，再加入650 μL洗柱液（10 mmol·L-1Tris-HCl，pH=7.5；70%乙醇），12 000 r·min-1离心30 s；⑤ 弃废液，空甩30 s，把残留的液体彻底去除掉；⑥ 取干净的1.5 mL离心管，在吸附柱的中间部位加入60 ℃预热的无菌水30～40 μL，12 000 r·min-1离心30 s，收集样品DNA溶液。试剂盒法（快速法）：参照一管式植物DNAout试剂盒说明书进行。

1.3.2 提取方法比较 分别采用经典法和改进法提取同一番茄植株叶片DNA，且每种方法中再分别设置选用冷冻样品与新鲜样品各0.1 g和0.2 g处理，10次重复，并分别记录提取时间；然后采用琼脂糖凝胶电泳法（上样量均为5 μL，下同）进行检测。

分别采用改进法和快速法提取同一番茄植株叶片DNA，由于快速法试剂盒说明书推荐的样品量为0.1 g，故两种方法中均分别设置选用冷冻样品与新鲜样品各0.1 g处理，3次重复；然后采用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。

采用改进法提取番茄植株叶片DNA，分别设置步骤②中添加50 μL KAC溶液和不添加KAC溶液2个处理，其他步骤相同，3次重复；然后采用琼脂糖凝胶电泳法进行检测。

1.3.3 TYLCV抗性的PCR检测 分别以1.3.2提取的番茄DNA为模板，以TY1-2F/TY1-2R、SCAR3-F/SCAR3-R为引物进行PCR扩增。反应体系（25 μL）为：2×PCR-Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 pmol·L-1）各1 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 9.5 μL。反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物采用1%琼脂糖凝胶电泳法进行检测，观察并记录。

2 结果与分析

2.1 不同样品量对DNA提取方法的影响

图1 不同样品量对DNA提取方法的影响

由图1可见，采用经典法和改进法提取的DNA条带都比较清晰明显，效果较好，两种方法提取的DNA纯度均能满足后续试验要求；但经典法（提取10个样品平均用时40 min）较改进法（提取10个样品平均用时30 min）用时较长。取样量分别为0.1 g和0.2 g时，提取的DNA只是在亮度上有轻微的差别；采用冷冻样品和新鲜样品提取的DNA无明显区别。

2.2 不同提取方法对DNA提取结果的影响

由图2可见，采用改进法提取的DNA条带清晰明显；采用快速法虽然用时较少，但基本没有条带显示，可以推测一管式植物DNAout试剂盒不适合番茄基因组DNA的提取。

图2 采用改进法和快速法提取的DNA电泳结果

由图3可见，在改进法步骤②中添加或不添加KAC溶液对DNA提取结果无明显影响。

图3 不同KAC含量对改进法DNA提取结果的影响

2.3 TYLCV抗性检测结果

由图4可见，采用经典法提取的DNA均能获得良好的目的条带；采用改进法，冷冻样品和新鲜样品的样品量为0.1 g的扩增效果均明显优于样品量为0.2 g；而采用快速法提取的DNA没有扩增出目的条带。另外，加入KAC溶液后提取的DNA目的条带较清晰。

通过检测可知，供试番茄潍科粉1号具有较好的TYLCV抗性，结果与吕金浮等（2014）对潍科粉1号品质特性的描述相符。

图4 TYLCV抗性检测结果

3 结论与讨论

本试验基于传统的提取植物基因组DNA的SDS法，结合商品化试剂盒的优点，经简化得到一种快速提取DNA的方法。由于商品试剂盒的保密性，无法获得试剂的具体成分及浓度，因此自行配制提取缓冲液和洗柱液等试剂，只是借用试剂盒中的结合缓冲液，经大量试验验证改进法提取的DNA能够满足番茄黄化曲叶病毒的抗性鉴定；本试验中样品研磨使用的是高通量组织研磨器（宁波新芝，SCIENTZ-48），一次最多可处理49个样品，很大程度上加快了研磨速度；如果没有该设备，也可用6 cm研钵替代，但将研磨液转移至2 mL离心管时会有部分损失。总之，改进法将商品化试剂盒和传统方法的液氮研磨步骤进行了简化和改进，同时避免了苯酚和氯仿等有毒试剂的加入，极大地节省了提取时间和试验成本，降低了试验危险性，非常适合番茄样品的大规模抗性检测。

本试验结果表明，当样品量较少（0.1 g）时，采用改进法提取的DNA扩增效果较好，这可能是因为样品量较大时DNA中残留较多的酚/多糖等物质，干扰了后续PCR反应；同时，样品量少也可以避免假阳性现象的发生。另外，在步骤②中加入KAC溶液后所得DNA的PCR扩增结果较好，可能是KAC的参与进一步促使大量蛋白质发生沉淀，以致未对PCR反应产生抑制，这与卢东柏等（2008）的研究结论一致。

本试验所涉及的3种方法均未使用RNA酶来降解DNA中残留的RNA，主要基于以下几个方面的考虑：第一，试验证实残留的RNA不会干扰后续的PCR扩增；第二，节省了RNA酶的孵育时间；第三，RNase A较为昂贵，节约了这部分试验成本。因此，在本试验提取的DNA电泳图谱中会看到残留的RNA。

在实际科研工作中，所采集的样品数量往往较多，无法在有限的时间内完成DNA提取工作，这就必须对样品进行冷冻保存，因此本试验对冷冻样品和新鲜样品进行了比较，结果显示两者均可以获得明亮的目的条带，并无明显差别。通过对番茄基因组DNA提取方法的改进和优化，为后续番茄TYLCV的抗性检测提供了方便和技术支持。

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李正美，杜雷，黄学华，景强，许冰莹，胡利平．2013．磁珠法在微量检材DNA提取中的应用．生物技术世界，（1）：7-9．

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Optimization and Application of DNA Extraction Methods for Detecting Tomato yellow leaf curl virus Resistance

QIAO Ning1，2，YAN Zhen-xin3，NI Xiu-mei1，DAI Hui-jie1，2，ZHU Xiao-ping2*，KONG Ling-guang2
（1Weifang University of Science and Technology，Shouguang 262700，Shandong，China；2College of Plant Protection，Shandong Agricultural University，Shandong Provincial Key Laboratory for Biology of Vegetable Diseases and Insect Pests，Taian 271018，Shandong，China；3Shandong Shouguang Fukang Pharmaceutical Co. Ltd. R&D，Shouguang 262700，Shandong，China）

The rapid and efficient method for tomato DNA extraction has been optimized and improved based on the conventional DNA extraction methods．The comparation improved method，the classic method（commercial kits）and rapid method（other kits）was carried out by the PCR analysis．The results showed that DNA obtained by improved method was slightly different comparing to the classic method with less time and funds when faced with large amount of test samples for detecting Tomato yellow leaf curl virus（TYLCV）resistance without the use of liquid nitrogen and other toxic solvents throughout the experiment．

Tomato yellow leaf curl virus（TYLCV）；DNA extraction；Resistance detection

乔宁，男，讲师，专业方向：蔬菜育种及病虫害防治，E-mail：qning78@163.com

*通讯作者（Corresponding author）：竺晓平，男，教授，专业方向：植物病理学，E-mail：zhuxp@sdau.edu.cn

2016-09-24；接受日期：2016-11-29

山东省科技发展计划项目（2010GNC10915），2015年度寿光市科技发展计划项目，山东省自然科学基金项目（ZR2015CQ022）