NIBP和NF—KB P65在胃癌中的表达及其临床意义

廖桂周

[摘要]目的研究NIBP（NIK-IKKB支架蛋白）和NF-KB p65（NF-KB核转录因子p65）在胃癌中表达的临床价值。方法回顾分析我院自2012年5月～2015年5月以来实施手术切除治疗的87例胃癌患者临床资料，对胃癌标本、癌旁组织、正常组织进行免疫组化染色，分别以荧光PCR定量法、Western blot法检测NIBP、NF-KB p65的表达情况。结果胃癌组织NIBP、NF-KB p65 mRNA表达、蛋白表达、免疫组化表达阳性率与癌旁组织、正常组织对比，均有统计学意义（P<0.05）。结论胃癌组织中NIBP、NF-K B p65均呈高表达状态，减少NF-KB p65转导途径的激活、抑制NIBP表达，可作为治疗胃癌切入点的依据，进行进一步的深入研究。

[关键词]NIK-IKKB；支架蛋白；核转录因子；胃癌；表达；临床意义

NIBP（NIK-IKKB支架蛋白）是一种自人脑细胞中新发现的特异性转录蛋白，能够与IKKB（I-kB蛋白激酶）、NIK（NF-kB诱导激酶）结合而发挥作用。研究显示，NIBP属于TRAPPC9基因编码，为1246个氨基酸所组成的一条多肽链，保守性极高。目前，肿瘤形成、发展、转归与NIBP的相关性报道并不多见。但近年来有研究指出，结肠癌组织可见NIBP表达增高，并且与NF-KB的活化具有密切关系。本研究回顾分析我院自2012年5月～2015年5月以来实施手术切除治疗的87例胃癌患者临床资料，旨在研究NIBP（NIK-IKK B支架蛋白）和NF-K B p65（NF-K B核转录因子p65）在胃癌中表达的临床价值，以期寻找胃癌合理化、规范化治疗方案的新切入点，为临床提供进一步理论依据，现报道如下。

1.资料与方法

1.1一般资料

我院自2012年5月～2015年5月以来实施手术切除治疗的87例胃癌患者临床资料，其中男81例，女6例，年龄最大81岁，最小32岁，平均（58.3±4.2）岁。入选患者均签署治疗、临床研究知情同意书，标本均通过病理证实确诊系胃癌，且取标本前均未进行放化疗治疗。其中距癌灶边缘10em以上切取胃组织标本为正常组织，距癌灶边缘5cm以上、10cm以内切取胃组织标本为癌旁组织。胃组织标本切去后将一部采用多聚甲醛（4.0%）固定、脱水，经透明及浸蜡包埋后，制成连续切片（厚4um）分别予以免疫组化、HE染色。其余标本置于-70℃液氮内保存，分别完成荧光PCR定量及Western blot检测。

1.2材料与试剂

NIBP兔抗人多克隆抗体（德国拜耳），NF-kBp65兔抗人多克隆抗体（德国拜耳），HRP（辣根过氧化物酶）标记IgG2005山羊抗鼠（德国拜耳）、HRP标记IgG2004山羊抗兔（德国拜耳）；SYBREX Premix TaqⅡ、反转录试剂盒、RNAiso Plus（美国辉瑞）；免疫组化DAB显色剂、sP即用型试剂盒（北京泰诺）；ECL试剂盒（北京泰诺）；蛋白BCA测定、提取试剂盒（北京泰诺）。

1.3免疫组化染色

SP免疫组化染色采用柠檬酸（0.01mol/L）先予5min热修复，以正常的山羊血清进行封闭后，再滴加抗NF-KBp65及抗NIBP一抗，于37℃环境下1h孵育，之后步骤参考试剂盒的说明书进行。阴性对照以PBS来代替一抗，阳性对照均系试剂盒的厂家所提供。如胞核、胞质有蓝褐色、蓝色颗粒出现判定為染色阳性（如图1～6所示），对阳性细胞数、染色强度予半定量分析。阳性细胞70%以上计3分、41.0%-70.0%计2分、10.0%～40.0%计1分、10.0%以下计0分。染色强度蓝褐色计3分、深蓝色计2分、蓝色计1分、不着色计0分。上述两项评分2分以上为阳性、2分以下为阴性。

1.4荧光PCR定量

分别切取正常胃组织、癌旁组织、胃癌组织各50mg，以TRIzol法进行总RNA抽提，依据试剂盒说明操作。将反转录RNAlug合成eDNA，再予实时荧光定量PCR扩增。NF-KBp65及NIBP反应条件相同，先于95℃环境下进行30s预变性，分别于95℃环境下5s及60℃环境下30s，循环40次。各反应管内到达荧光信号的域值循环数35以上为阴性表达，35以下、15以上即阳性表达。各基因样品均设置重复扩增管3个，内参GAPDH，双Delta ct定量分析。见表1。

1.5Western blot法检测

以常规方法完成组织蛋白的提取后，以BCA法进行蛋白浓度测定。将变性后蛋白60ug予聚丙烯酰胺10%凝胶内电泳，于冰浴下进行恒流电转，获得PVDF（聚偏氟乙烯）膜后，以脱脂奶粉（5.0%）对非特异性抗原进行封闭。分别将NIBP兔抗人多克隆抗体、NF-kc B p65兔抗人单克隆抗体一抗加入，于4℃环境下孵育过夜。以含TBST（Tween20、0.1%）进行洗膜，再加入二抗（被HRP标记），于室温下进行1h孵育。完成洗膜后，再加入ECL Plus化学发光增强底物，于x线曝光下常规显影。以凝胶成像系统进行图像分析。

1.6统计学处理

选择SPSS19.0软件对数据予以统计处理，计量资料以（x±s）表示，采用f检验，计数资料以百分比表示，采用x2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1胃癌组织及周围组织NIBP、NF-KB p65 mRNA表达情况

胃癌组织NIBP、NF-K B p65 mRNA表达水平与癌旁组织、正常组织对比，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

2.2胃癌组织及周围组织NIBP、NF-KB p65蛋白表达情况

胃癌组织NIBP、NF-K B p65蛋白表达水平与癌旁组织、正常组织对比，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

2.3胃癌组织及周围组织NIBP、NF-KB p65免疫组化表达阳性率

胃癌组织NIBP、NF-K B p65免疫组化表达阳性率与癌旁组织、正常组织对比，差异有统计学意义（P<0.05）。见表4。

3.讨论

NF-kB（核转录因子）是广泛存在于哺乳动物机体细胞核内的一种转录因子，能够影响肿瘤细胞增殖、分化，对肿瘤患者病程进展、预后都具有非常重要的临床意义。文献报道，胃癌细胞及其病变组织中NF-kB被异常激活，经经典、非经典信号转导通路调节，可以使NF-K B关键酶NIK、IKK B形成三聚体结构的支架蛋白。另据研究显示，NIBP能够使TNF-a（肿瘤坏死因子）所诱导经典NF-K B转导途经激活。因此，NF-K B转导通路激活的NF-K B p65表达、NIBP表达与胃癌的关系，可能对胃癌治疗切入点具有重要意义。

近年来已有文献报道NIBP在结肠癌中的表达，与结肠癌临床分期、浸润深度及远处转移均有密切关系，其中远处转移者或晚期姑息治疗者，NIBP表达阳性率显著增高。而在本文结果中，胃癌组织NIBP表达与癌旁组织、正常胃组织对比，均有明显差异，呈增高表现。这说明胃癌发生可能与NIBP水平具有密切关联，对胃癌治疗切人点具有重要意义。

静息时NF-kB可呈无活性前体状态于细胞胞质中存在，如被激活则可引发存活蛋白、细胞周期D1蛋白、金属基质蛋白酶、bcl-2等靶基因转录，对肿瘤细胞产生抑制凋亡作用，加速正常细胞向肿瘤细胞转化，促进肿瘤血管的生成甚至肿瘤远处转移等，对恶性肿瘤病程进展、预后都有较大影响。据文献报道，人胃正常组、胃癌旁组织、胃癌组织中NF-kB p65表达呈递减趋势，并且胃癌病理分期、腫瘤直径、浸润深度、转移情况与NF-kB p65表达均有密切关系。在本文结果中，NF-K B p65在胃癌组织中的表达较正常胃组织、癌旁组织均有明显差异，呈高表达状态，说明胃癌发生、病程进展与NF-kB p65表达具有非常密切的关系，对胃癌治疗切入点也具有重要意义。

据文献报道，NIBP呈高表达状态，能够使IKK B、NF-K B p65的磷酸化加速，对NF-K B转导途径起到激活剂效果。尽管IKKa表达增强能够抑制IKKB的磷酸化，但NIBP呈高表达状态下，NF-K B p65的磷酸化也随之加速，说明IKK B功能在此由NIBP补充，所以NIBP是通过对NF-kB转导通路进行调节，干预胞内蛋白质的转运过程。另据研究显示，小鼠肠道NIBP表达增加后，NF-K Bp65转录随即被激活，主要是NIBP表达受shRNA抑制，从而使NF-KB p65的激活受到抑制。所以，NF-KB转导通路中NIBP具有至关重要的作用。

综上所述，胃癌组织中NIBP、NF-KB p65均呈高表达状态，而减少NF-kB p65转导途径的激活、抑制NIBP表达，可作为治疗胃癌切入点的依据，进行进一步的深入研究。