水通道蛋白—7在小鼠肾集合管发育过程中的表达分析

王雅光+阎丽菁+田鹤

[摘要]目的探讨水通道蛋白-7（aquaporin-7，AQP-7）在小鼠肾集合管发生发育过程中的表达和作用。方法采用免疫组化结合体视学测量和免疫印迹技术，测定胚龄（E）16、18d胎鼠及生后（P）1、3、5、7、14、21、42、70d仔鼠肾集合管中AQP-7的表达及含量变化。结果通过体视学测量和免疫印迹技术结果显示：AQP-7在胚龄16d的小鼠肾集合管开始弱表达，到生后21d达到高峰，之后随着日龄的增加，表达无明显变化。结论AQP-7主要表达在发育中小鼠肾集合管中，可能和肾集合管的发育和成熟相关。

[关键词]水通道蛋白-7；肾；集合管；小鼠；发育

水通道蛋白-7（aquaporin-7，AQP-7，也叫AQPap），AQP-7是从脂肪组织中分离鉴定出的一种水孔蛋白基因，其蛋白质是水通道蛋白家族中的一个成员。水通道蛋白普遍存在于微生物、植物、及动物界。AQP-7在肾脏中的表达水平较高，属于甘油水通道蛋白，同时对肾脏中水份的重吸收和尿液的浓缩都起着重要作用。有大量的研究表明，甘油水通道蛋白在允许水分子通过的同时也可以允许一些其它的中性溶质通过。甘油水通道蛋白在多种组织中都有重要的生理功能；例如在脂肪组织，上皮组织中，特别是在细胞受损的快速增殖期能为其提供能量，而器官的发生发育也是细胞快速增值的过程。关于水通道蛋白在肾脏中发生发育的文献报道有很多，其中与AQP-7属于同一亚家族的AQP-3在肾脏集合管表达的文献也很常见。基于这些，我们试想AQP-7也可能在肾脏集合管的发生发育中起到一定的作用。本研究采用免疫组织化学和免疫印迹的技术探讨AQP-7在肾脏集合管的发育中的作用。

1资料与方法

1.1一般资料

2015年3月～10月期间由辽宁医学院实验动物中心提供的健康2月龄昆明小鼠（雌雄比例1：1），体重25g，随机合笼。观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚龄（embryonic days，E）0d。观察到仔鼠出生的最早时间计为生后（postnatal，P）Od。孕鼠分为10组，每组3只，每只孕鼠取2只胎鼠或仔鼠。分别取胚龄16、18d胎鼠和生后1、3、5、7、14、21、42、70d仔鼠各6只，共60只。兔抗小鼠AQP-7多克隆抗体购自Santa公司；SABC免疫组化试剂盒购自中杉金桥生物技术有限公司；膜蛋白提取试剂盒、Polyvinylidene Fluoride膜、SodiumDodecyl Sulfate等免疫印迹试剂均购自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1肾脏标本制备用100g/L水合氯醛将麻醉后，立即剖开孕鼠腹腔将胎鼠取出，E16、18d胎鼠取左肾全肾固定。仔鼠断头处死后，从腹后壁取左肾，沿横轴将肾切成约3mm薄片，放人40g/L多聚甲醛固定，梯度酒精脱水，香柏油透明，石蜡定向包埋，做连续切片，厚度5μm。右肾均入冰丙酮迅速冷冻，-80℃保存，供免疫印迹使用。

1.2.2体视学测量

以免疫组化染色切片进行体视学测量，每组选5张切片，每张切片按“s”形在油镜下选取5个视野，应用方格测试系统，交点计数法测算集合管阳性反应表达的面密度值，其公式为：Sv=21x/Lc（Lc=∑Pc·a），式中Ix是阳性表达的胞膜与测试方格系统的交点数，Pc是测试系统落在参照系（集合管）的点数，a代表方格两点间距离，实际长度相当于0.1mm。

1.2.3免疫印迹检测取各组冷冻待用的右肾称重，剪碎后，冰浴中加入膜蛋白抽提试剂，抽提膜蛋白，考马斯亮蓝法蛋白质定量。每种样品取20μg湿转到PVDF膜上。用100g/L脱脂奶粉封闭，加AQP-7抗体（浓度1：200）4℃孵育过夜后，碱性磷酸酶标记的二抗（浓度1：600）摇床室温孵育1h，ECL显色，用Fluorchem V2.0系统测定光密度值。

1.3统计学分析

采用SPSS16.0软件对研究所得数据建立数据库，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1体视学测量结果

通过对AQP-7免疫组织化学染色阳性切片（免疫组织化学染色图片本篇论文未显示）进行体视学分析得到如下结果：随着胚日龄的增加，AQP-7在集合管表达的面密度值逐渐增加，P7天后增加明显，P21天达到顶峰后趋于稳定。见表1。

2.2免疫印迹检测结果

AQP-7蛋白表达的电泳条带用Gene Tools软件分析，测定光密度值，以测得的光密度最大值记为1，计算各组小鼠肾组织中AQP-7的相对表达量（百分数）。结果显示随着小鼠肾的发育AQP-7表达量逐渐增加，P7d后增加明显，P21d达到峰值后趋于稳定。经统计学分析，各组间数值的差异具有统计学意义（P<0.05），见表2。

3讨论

水通道蛋白是允许水和甘油等小分子通透的膜蛋白通道，以四聚体形式位于质膜上，每个单体含有一通道。水通道蛋白功能异常与很多疾病相关，例如先天性白内障、肾源性尿崩症。迄今为止，在人体已发现13种水通道蛋白fAQP0-12）。1997年首次从脂肪组织克隆了人类AQP7基因，它既能通透水也能易化甘油从细胞内流出。AQP7在肾脏、睾丸、卵巢、心脏、胃肠道、骨骼肌等组织中均有不同程度的表达，调控脑的发育和精子的形成。肾组织中富含水通道蛋白，共有8种，即，AQP1、AQP2、AQP3、AQP4、AQP6、AQP7、AQP8和AQP11。对于AQP-7在肾脏中的作用，学者们进行了一些研究，AQP-7基因敲除的小鼠尿量增加。集合管的主要功能是浓缩尿液，进一步重吸收原尿中的水分。为了探讨AQP-7与肾脏集合管发生发育的关系，本研究通过免疫组织化学技术结合体视学方法及免疫印迹法检测AQP-7在小鼠肾集合管发生发育过程中的表达及其含量变化。

AQP-7表达于集合管上皮细胞的细胞膜，本实验的体视学测量结果显示AQP-7的面密度值随着肾脏的发育逐渐增加，在生后21d达到最大值，之后维持不变。免疫印迹检测结果显示AQP-7在E16天开始有少量表达，蛋白含量随肾脏发育逐渐增加，至P21d达最高峰，之后维持这一含量。小鼠发育过程中，集合管在胚胎16d开始出现，此时AQP-7开始出现弱表达，说明肾集合管的早期发育过程中有AQP-7的参与，此时的肾脏已具备通透水和（或）甘油等小分子物质的功能。小鼠出生后，肾组织中AQP-7的含量逐渐增加，至P21d，AQP-7的表达达到最高值，此段时期，是肾髓质体积迅猛增加的时期，是尿液浓缩能力变化较大的时期，集合管细胞水通道蛋白的表达量是影响尿液浓缩能力的关键因素，AQP-7蛋白含量在肾脏发育过程中的变化表明它是影响集合管重吸收水分的膜蛋白，对尿液浓缩发挥一定的作用，本实验结果与前人相一致。

至今，关于AQP7在人体表达的研究还很少，简单的以啮齿类动物的研究数据来推测人体显然是应该尽量避免的。为了更好的明确AQP7的表达和作用，蛋白和基因表达方面的研究还有待进一步开展。