鸡新城疫病毒中和单克隆抗体的制备及鉴定

李青梅，王 丽，冯丽丽，张雨杭，赵 东，杨艳艳，邢广旭，柴书军，李赛赛，张丽萍，郭军庆*，张改平，，4*

（1.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州450002；2.河南省农业科学院农业经济与信息研究所，河南郑州450002；3.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002；4.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009）

鸡新城疫病毒中和单克隆抗体的制备及鉴定

李青梅1，王 丽1，冯丽丽2，张雨杭3，赵 东1，杨艳艳1，邢广旭1，柴书军1，李赛赛1，张丽萍1，郭军庆1*，张改平1，3，4*

（1.河南省农业科学院动物免疫学重点实验室，河南郑州450002；2.河南省农业科学院农业经济与信息研究所，河南郑州450002；3.河南农业大学牧医工程学院，河南郑州450002；4.江苏高校动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心，江苏扬州225009）

采用差速离心法纯化鸡新城疫病毒（NDV）标准毒株F48E8，免疫Balb/c小鼠，应用杂交瘤细胞技术制备抗NDV单克隆抗体，旨在为NDV中和抗原表位分析奠定基础。将NDV感染BHK-21细胞，建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）的单克隆抗体检测方法，筛选获得14株分泌抗NDV单克隆抗体杂交瘤细胞株，其单克隆抗体腹水IPMA效价均在0.50×10-2～2.56×10-5（F48E8株和LaSota株）。血凝抑制试验（HI）结果表明，单克隆抗体1G6、2C1、4D2、5F2和13A5具有血凝抑制活性，其HI效价在（6～12）log2（F48E8株）和（9～11）log2（LaSota株）。病毒中和试验结果表明，单克隆抗体5F2和13A 5对F48E8株和LaSota株均有明显的病毒中和活性，中和效价分别为1∶400～1∶800和1∶25。夹心ELISA结果表明，单克隆抗体5F2识别NDV HN蛋白，13A5识别F蛋白。综上，成功制备了具有中和活性的NDV单克隆抗体（5F2和13A5）。

鸡新城疫病毒；单克隆抗体；免疫过氧化物酶单层细胞试验；血凝抑制试验；中和试验；中和活性

鸡新城疫（Newcastle disease，ND）又称亚洲鸡瘟，是由鸡新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）引起的一种以呼吸道、消化道黏膜出血为典型病变的高度接触性、急性败血性禽类传染病，世界卫生组织（OIE）将其列为应呈报疫病，我国将其列为一类动物传染病［1-2］。我国采用弱毒疫苗预防控制了ND的大规模流行，但ND的流行和发病特点又发生新变化，多表现为非典型和慢性感染，出现了所谓“非典型新城疫”和“温和型新城疫”，同时NDV与禽流感病毒等其他呼吸道病原混合感染也十分普遍，使得ND的临床诊断和防制更加困难。

NDV为有囊膜、不分节段、单股负链RNA病毒，属于副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病毒亚科（Paramyxovirinae）禽腮腺炎病毒属（Avulaviruss），其血清型为禽副黏病毒1型（APMV-1）［1］。NDV基因组长度为15 186、15 192或15 198个核苷酸（nt），含有6个开放阅读框（ORF），依次编码核衣壳蛋白（Nucleocapsid，N）、磷蛋白（Phosphoprotein，P）、基质蛋白（Matrix，M）、融合蛋白（Fusion，F）、血凝素-神经氨酸酶蛋白（Heamagglutinin-Neuram inidase，HN）和大RNA依赖RNA聚合酶（Large RNA dependent RNA-polymerase，L）6个结构蛋白，其中F和HN蛋白是NDV表面重要的2个囊膜糖蛋白，为病毒的中和抗原，负责病毒吸附和细胞膜融合，在病毒感染过程中起到重要的作用［3］。NDV根据其基因组长度和F基因序列分为ClassⅠ和ClassⅡ2大系谱，后者包含大多数强毒株和弱毒株，主要分布于家禽和野鸟，根据F基因序列又分为10个基因型（Ⅰ—Ⅹ）：基因Ⅰ型NDV除1998—2000年澳大利亚强毒株外，其余均为弱毒株；基因Ⅱ型NDV除广泛用于活疫苗的弱毒株（如LaSota株等），还有中等毒力毒株和高致病力的强毒株；而Ⅲ—Ⅹ型NDV均为强毒株［4］。流行病学数据表明，20世纪90年代中期，我国出现了NDV基因Ⅶ型，并且其成为我国NDV流行的优势基因型，当前Ⅶd亚型在我国流行强毒株中已占有绝对优势［2，5］。在NDV单克隆抗体方面，Panshin等［6-7］利用抗NDV HN、F、M、N蛋白等系列单克隆抗体对NDV分离毒株的抗原表位进行分析发现，分离毒株的病毒蛋白与疫苗株均存在抗原差异，而M蛋白的抗原表位差异最显著。Hu等［8］利用5株具血凝抑制（HI）活性单克隆抗体对15株NDV强毒株进行分析发现，HN蛋白347位氨基酸残基的E/G→K的突变导致抗原表位（345—353位）缺失。然而，目前对NDV抗原表位特别是中和抗原表位特征及其变异规律尚缺乏系统分析。

本研究利用NDV感染BHK-21细胞建立异源免疫过氧化物酶单层细胞试验（IPMA）单克隆抗体检测方法，筛选具有中和活性的NDV单克隆抗体，以期为NDV中和抗原表位分析奠定基础，为NDV新型疫苗的分子设计和免疫评价提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 毒株与细胞

鸡新城疫病毒标准毒株F48E8和疫苗毒株Lasota均购自中国兽药监察所，分离毒株G1、G2、ND1、ND6、ND7、XX-08由本实验室分离鉴定；小鼠浆细胞瘤细胞系NS0由英国国家动物健康研究院惠赠，以含10%胎牛血清1640培养基培养，用于细胞融合；乳仓鼠肾细胞BHK-21由本实验室保存，以含10%胎牛血清DMEM培养基培养，用于NDV感染试验。

1.2 供试动物

SPF级Balb/c小鼠购自郑州大学医学院实验动物中心，在SPF级IVC笼中饲养，用于动物免疫；SPF鸡胚购自北京梅里亚维通实验技术有限公司，用孵化器孵育至9～10日龄，用于NDV增殖。

1.3 抗原制备

以9～10日龄SPF鸡胚培养NDV标准毒株F48E8与疫苗毒株Lasota，收集尿囊液，以差速离心纯化培养病毒。取尿囊液200 m L，4℃、3 000 r/min离心30 min，取上清；冻融3次后，4℃、8 000 r/min离心15 min，取上清；4℃、60 000 r/min离心60 min，弃上清；以5 m L PBS缓冲液（pH值7.2）充分重悬沉淀，测量蛋白质含量和血凝（HA）效价。

1.4 动物免疫

选取5只6周龄Balb/c小鼠，免疫剂量为100 μg/只。首次免疫以等量弗氏完全佐剂乳化抗原，皮下多点注射，每只100μL；加强免疫以弗氏不完全佐剂乳化抗原，每次间隔21 d加强免疫1次，第3、4次免疫后20 d断尾分离血清，以HI试验测定血清效价；超强免疫在融合前3～5 d小鼠腹腔注射50μg NDV抗原。

1.5 细胞融合

取超强免疫后4 d的小鼠进行细胞融合，无菌手术取出脾脏，研磨分离成单个脾细胞，与NS0细胞按常规方法进行融合［9］。用HAT培养基对融合细胞进行选择性培养，第10～12天取细胞上清进行阳性克隆筛选，选择强阳性细胞孔以有限稀释法进行克隆，建立稳定分泌抗NDV单克隆抗体的杂交瘤细胞株。

1.6 单克隆抗体制备

以体内诱生腹水法制备抗NDV单克隆抗体，将（2～5）×106个细胞腹腔注射经液体石蜡致敏的8周龄Balb/c小鼠，10～15 d后抽取小鼠腹水，分别以H I试验、IPMA试验和夹心ELISA法测定腹水的抗体效价。

1.7 HA与H I试验

在96孔“V”型微量反应板倍比稀释NDV尿囊液，50μL/孔，每孔加入等量0.5%鸡红细胞，室温静置30 min，观察红细胞凝集，以100%凝集的最大稀释度为尿囊液HA效价。在微量反应板加4×HA单位NDV尿囊液（第1列8×HA单位），50μL/孔；在第1列加入待检等量腹水，并进行倍比稀释，最后1列设PBS对照，室温作用30 min；每孔加入等量0.5%鸡红细胞，室温静置30 min，观察红细胞凝集，以100%抑制凝集的最大稀释度为腹水HI效价。

1.8 IPM A试验

利用NDV F48E8株和LaSota株感染BHK-21细胞，建立NDV单克隆抗体的异源IPMA检测方法。在96孔细胞培养板培养BHK-21细胞至80%，分别接种NDV毒株，感染12 h后，弃去培养上清，每孔加入含0.1%H2O2的甲醇溶液，室温固定15 min；5%脱脂奶37℃封闭1 h；将待检杂交瘤细胞上清或梯度稀释腹水分别加入NDV感染孔中，37℃反应30 m in；每孔加入羊抗鼠酶标二抗，37℃反应30 min；上述每步均以含0.05%Tween-20的PBS充分洗涤；加入AEC显色液室温显色10～15 min，在显微镜下观察显色。

1.9 病毒中和试验

应用Reed-Muench方法测定NDV F48E8株和LaSota株对BHK-21的半数细胞感染量（TCID50）。将不同稀释度的单克隆抗体腹水与100 TCID50NDV混合，37℃反应30 min，然后感染BHK-21细胞，感染24 h后，利用鸡NDV阳性血清以IPMA法检测NDV的感染，以100%抑制NDV感染的稀释度为腹水中和效价。

1.10 夹心ELISA试验

用0.05 mol/L碳酸盐缓冲液（pH值9.6）1∶200稀释NDV IgG，包被96孔酶标板，50μL/孔，4℃过夜；经5%脱脂奶37℃封闭1 h后，加入适当稀释的HN和F转基因水稻重组蛋白，37℃反应30 min；每孔加入待检杂交瘤细胞上清或梯度稀释腹水，50μL/孔，37℃反应30 min；每孔加入羊抗鼠酶标二抗，37℃反应30 min；上述每步均以含0.05% Tween-20的PBS充分洗涤；加入TMB显色液室温显色5～10 min，2 mol/L H2SO4终止显色，酶标仪读取OD450值，计算待检抗体S/N值（S/N=ODmAb/ ODPBS），并进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 NDV培养与纯化结果

用SPF鸡胚培养NDV标准毒株F48E8，尿囊液经差速离心后，获得初步纯化病毒，其蛋白质含量为5.3 mg/m L，HA效价为12log2。

2.2 抗NDV单克隆抗体杂交瘤细胞筛选结果

以NDV F48E8株和LaSota株感染BHK-21细胞对NDV杂交瘤细胞上清进行异源IPMA检测，筛选抗体阳性杂交瘤细胞50余株，经连续3次亚克隆，获得分泌抗NDV单克隆抗体的杂交瘤细胞14株（1B3、1G6、2A5、2C1、3C2、3D10、4D2、5D6、5D7、5E10、5F2、13A5、15H6、16G2），并制备了相应的单克隆抗体腹水，单克隆抗体的IPMA结果见图1。

2.3 抗NDV单克隆抗体效价

分别以IPMA和HI试验测定抗NDV单克隆抗体腹水的抗体效价，结果见表1。14株单克隆抗体对NDA标准毒株F48E8和疫苗毒株LaSota的IPMA效价均在0.50×10-2～2.56×10-5；HI试验结果显示，单克隆抗体1G6、2C1、4D2、5F2和13A5具有HI活性，其对NDV标准毒株F48E8和疫苗毒株LaSota的HI效价分别在（6～12）log2和（9～11）log2。值得注意的是，单克隆抗体2C1在IPMA和HI试验中均识别强毒株F48E8，但均不识别疫苗毒株LaSota。

2.4 抗NDV单克隆抗体识别NDV的反应谱

分别以NDV标准毒株、流行毒株和疫苗毒株感染BHK-21细胞，检测抗NDV单克隆抗体识别NDV的反应图谱，IPMA结果显示，除单克隆抗体2C1只识别NDV标准毒株F48E8外，其他单克隆抗体均识别NDV标准毒株、流行毒株和疫苗毒株，具有较广的NDV反应谱（表2）。

2.5 抗NDV单克隆抗体中和活性

分别以不同稀释度抗NDV单克隆抗体腹水处理适当稀释的NDV毒株，然后接种BHK-21细胞，利用鸡NDV阳性血清、以IPMA法测定病毒对细胞的感染情况，评估抗NDV单克隆抗体对NDV的中和活性，结果显示，单克隆抗体5F2和13A5能抑制NDV标准毒株F48E8和疫苗毒株LaSota对细胞的感染，具有病毒中和活性。2株单克隆抗体腹水对F48E8株的中和效价分别为1∶800和1∶25，对LaSota株的中和效价分别为1∶400和1∶25。

2.6 抗NDV单克隆抗体识别病毒蛋白

分别利用转基因水稻表达的NDV HN和F重组蛋白以夹心ELISA测定抗NDV单克隆抗体所识别的病毒蛋白，根据待检抗体的OD450计算S/N值，并设定临界值为2.5。由图2可知，单克隆抗体1G6、4D2、5D6、5F2、15H6和16G2检测HN重组蛋白的S/N值显著高于F重组蛋白和临界值，表明其识别NDV HN蛋白；单克隆抗体1B3、2A 5、2C1、3C2、3D10、5E10和13A5检测F重组蛋白的S/N值高于HN重组蛋白和临界值，表明其识别NDV F蛋白；单克隆抗体5D7对HN和F重组蛋白的S/N值低于2.5，提示其可能识别NDV其他病毒蛋白。值得注意的是，具有病毒中和活性的单克隆抗体5F2和13A5分别识别HN蛋白和F蛋白。

3 结论与讨论

NDV为囊膜病毒，HN和F蛋白等病毒蛋白镶嵌在病毒囊膜中，在病毒感染和免疫识别中发挥重要作用，也是疫苗设计和免疫检测的重要靶标蛋白。病毒密度梯度离心是病毒纯化的常用方法，能够获得较高纯度的病毒粒子，然而在长时间的超速离心过程中，病毒囊膜容易受损，导致囊膜蛋白脱落和丢失。本试验采用低速和中高速离心去除尿囊液杂质后，通过超速短时离心纯化病毒粒子，既获得较高纯度的病毒，又最大限度降低超速离心对病毒囊膜的损害，保证纯化病毒具有良好感染毒力和血凝活性，为获得病毒囊膜蛋白单克隆抗体提供基础保障。

阳性杂交瘤细胞的筛选是单克隆抗体生产鉴定的关键。NDV免疫抗原中的鸡胚尿囊液成分诱导产生的抗体是单克隆抗体筛选的最大障碍，本试验前期尝试H I试验、间接ELISA和夹心ELISA等筛选方法，均不能有效区分针对病毒与鸡胚成分的抗体。鉴于NDV不仅能在鸡胚成纤维细胞（CEF）增殖，而且可以感染多种哺乳动物细胞［10］，本试验以NDV感染BHK-21细胞建立了异源IPMA抗体筛选方法，NDV感染的BHK-21细胞只能被NDV阳性血清或抗体特异识别，不与其他抗体发生非特异反应，有效屏蔽了抗鸡胚成分抗体的干扰，实现了NDV单克隆抗体的高效筛选，切实提高了单克隆抗体的生产鉴定效率。

本试验获得了2株具有病毒中和活性的单克隆抗体5F2和13A5，且对NDV标准毒株和疫苗毒株均显示良好中和作用，其中，5F2识别NDV HN蛋白，而13A5识别F蛋白，提示上述2株单克隆抗体识别NDV的中和抗原表位保守性强，对其识别抗原表位的分析鉴定，将为NDV新型疫苗和免疫评价技术研究奠定良好基础。

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Production and Characterization of Neutralizing Monoclonal Antibodies against Newcastle Disease Virus

LIQingmei1，WANG Li1，FENG Lili2，ZHANG Yuhang3，ZHAO Dong1，YANG Yanyan1，XING Guangxu1，CHAIShujun1，LISaisai1，ZHANG Liping1，GUO Junqing1*，ZHANG Gaiping1，3，4*
（1.Key Laboratory of Animal Immunology，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；2.Institute of Agricultural Economics and Information，Henan Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou 450002，China；3.College of Animal Husbandry and Veterinary Medicine，Henan Agricultural University，Zhengzhou 450002，China；4.Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Yangzhou 225009，China）

Balb/c mice were immunized by the Newcastle disease virus（NDV）reference strain F48E8 purified by differential centrifugation，and used formonoclonal antibodies（m Abs）production using hybridoma technology.After screened by a heterologous immunoperoxidase monolayer assay（IPMA）based on the NDV-infected BHK-21 cells，fourteen hybridoma cell lines secreting mAbs specific for NDV were obtained，whose antibody titers of ascites were determ ined to be 0.50×10-2—2.56×10-5to F48E8 and to La-Sotain by IPMA respectively.In hemagglutination inhibition（H I）assay，mAbs 1G6，2C1，4D2，5F2 and 13A5 showed hemagglutination-inhibitory activity with the HI titers of 6—12log2（F48E8）and 9—11 log2（LaSota），of which mAbs 5F2 and 13A5 showed significant neutralizing activity to both NDV virulent and vaccine strains in the virus neutralization（VN）testw ith the titers of 1∶400—1∶800 and 1∶25 respectively.Furthermore，sandwich ELISA using the recombinant proteins showed that mAb 5F2 reacted with HN protein of NDV，whilem Ab 13A5 recognized the F protein.In conclusion，the NDV m Abs of 5F2 and 13A5 with neutralization activity were obtained successfully.

Newcastle disease virus；monoclonal antibodies；immunoperoxidase monolayer assay；hemagglutination inhibition assay；neutralization assay；neutralization activity

S855.3

A

1004-3268（2017）01-0127-05

2016-09-20

国家重点研发计划项目（2016YFD0500800）；公益性行业（农业）科研专项（201303033）；河南省科技攻关项目（162102110051）

李青梅（1972-），女，河南郑州人，副研究员，主要从事快速检测技术研究。E-mail：350164155@qq.com

*通讯作者：张改平（1960-），男，河南内黄人，研究员，博士，主要从事动物免疫学研究。E-mail：zhanggaiping2003@163.com郭军庆（1970-），男，河南林州人，研究员，博士，主要从事动物免疫学研究。E-mail：13838248132@163.com