一种快速检测小麦赤霉病菌种类的方法

张 林，张梦雅，康 健，闫红飞，刘大群

（河北农业大学植物保护学院/国家北方山区农业工程技术研究中心/河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心，河北保定071000）

一种快速检测小麦赤霉病菌种类的方法

张 林，张梦雅，康 健，闫红飞*，刘大群*

（河北农业大学植物保护学院/国家北方山区农业工程技术研究中心/河北省农作物病虫害生物防治工程技术研究中心，河北保定071000）

为建立一种能够快速、简便和准确检测我国小麦赤霉病菌种类的方法，直接采用发病麦穗快速提取DNA，并结合特异性分子标记对采自我国的小麦赤霉病菌种类进行快速检测。该检测方法成功实现了对小麦赤霉病菌基因组DNA的快速提取和特异性分子标记检测，通过对河北、河南、江苏、安徽四省41份样本的检测验证，结果显示，安徽合肥与江苏南京地区的18份材料均为亚洲镰刀菌（Fusarium asiaticum），河北安新与赵县地区的12份材料均为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum），而河南地区的11份材料中2种致病菌株均有出现，检测结果与已经报道的这2种致病菌的地区分布情况一致。该方法不仅可以达到传统方法（CTAB法提取DNA）的效果，而且与之相比还具有快速、简便的优点，可用于小麦赤霉病菌群体结构和地区分布情况的研究。

小麦；赤霉病菌；快速检测；禾谷镰刀菌；亚洲镰刀菌

小麦赤霉病是一种世界性病害，在各小麦生产国普遍发生，尤其是在气候潮湿多雨地区危害严重［1］，且目前缺少免疫或高抗的小麦品种［2］。我国小麦赤霉病发生频率高且危害严重，其在小麦各生育期均可危害，以穗部危害为主［3］，一般发病年份引起减产10%～15%，严重时损失可达20%～40%［4-5］；在其危害过程中还会产生DON毒素（脱氧雪腐镰刀菌烯醇）并积累于籽粒中［6］，不仅降低了小麦品质［7］，食用后还会引起人畜中毒［8-9］。我国历史上小麦赤霉病的首次暴发流行发生在1936年［10］，之后2003年和2012年为2个特大流行年份。2000年以来，江苏［11-12］和安徽［13-15］两省在2003、2010、2012、2014、2015年发生均非常严重，流行频率日趋增加，发生区域也逐渐向北蔓延扩展［16-18］。

据报道，我国冬小麦主产区小麦赤霉病的主要致病菌为禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）和亚洲镰刀菌（Fusarium asiaticum），且黄淮流域及以北地区以F.graminearum为主，长江中下游的南方地区以F.asiaticum为主［19］，不同种类赤霉病菌的致病力与产生的毒素类型存在差异［20-21］。因此，研究致病菌种群组成及结构的变化，可为小麦赤霉病的预测预报、综合防治与抗病育种提供依据［22］。目前，分子检测技术已应用于小麦赤霉病菌种群组成与结构的分析［23］，尤其是特异分子标记的开发［24］，使得小麦赤霉病菌种类检测鉴定较之以往形态鉴定更为快速准确。但目前小麦赤霉病菌种类的分子检测鉴定方法仍较为繁琐，主要体现在需对病菌进行分离培养，菌株DNA的提取一般采用CTAB法或SDS提取法［3-4，8，16-17，19-20，25-27］，整个检测鉴定过程费时费工。

鉴于上述检测小麦赤霉病菌种类方法的不足，本试验旨在建立一种更为简便、快速和准确的检测小麦赤霉病菌种类的方法。通过摸索，初步确定了Chelex-100法直接从病穗上提取病原菌DNA，并与特异性分子标记检测相结合的方法，将为简便、快速检测鉴定小麦赤霉病菌种类，并明确其群体组成、结构变化和地区分布提供帮助。

1 材料和方法

1.1 小麦赤霉病标样材料的采集

检测材料要求采集带有粉红色霉层的小麦病穗，可根据病穗上产生粉红色霉层情况进行采集，若一个病穗上有1～2个小穗发病且产生粉红色霉层，则采集病穗2～3穗即可。本研究所用材料为2015年采自于河北省、河南省、安徽省和江苏省符合以上标准的41份赤霉病穗材料和2014年采自安徽白湖农场、河北安新2份材料的分离菌株（由河北农业大学分子植物病理和生物防治实验室分离、鉴定并保存）与所保存的病穗。

1.2 小麦赤霉病菌基因组DNA提取

2份已鉴定菌株材料DNA的提取采用2种方法：CTAB法［3］提取培养菌株的菌丝DNA和Chelex-100法［28］从已知菌株所保存的病穗提取DNA；41份样本的DNA提取采用Chelex-100法。用紫外分光光度仪检测样品DNA的浓度和纯度。Chelex-100法具体操作如下：（1）用刮刀直接刮取小麦赤霉病穗上2～3个发病小穗颖壳上粉红色霉状物，并置于1.5 m L灭菌的离心管中；（2）用移液器加入30～40μL 20%的Chelex-100，混匀；（3）沸水浴2～3 min，取出后，涡旋振荡10 s，再沸水浴5 min；（4）取出离心管，8 000 r/min离心3 m in，上清液即可作为PCR模板。

1.3 小麦赤霉病菌的PCR检测体系

以2个已知小麦赤霉病菌基因组DNA为模板，利用赤霉病菌特异引物Fg11（F：5′-CTCCGGGATATGTTGCGTCAA-3′；R：5′-GGTAGGTATCCGACATGGCAA-3′）［29］进行PCR扩增，该引物在F.asiaticum中可扩增出497 bp片段，在F.graminearum中可扩增出410 bp片段。

PCR反应体系（10μL）：模板DNA（30 ng/μL）1μL，Taq酶（2.5 U/μL）0.1μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.2μL，dNTPs（10mmol/L）0.2μL，10 ×PCR Buffer 1μL，用无菌超纯水补充反应体系至10μL。反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环；72℃延伸5 min，4℃保存。以上PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 小麦赤霉病菌检测效果验证

利用特异引物Fg11对41份样本进行扩增，PCR扩增体系与程序同上，验证该检测方法的准确性。

2 结果与分析

2.1 小麦赤霉病菌检测方法的确立

采用CTAB法和Chelex-100法提取已知小麦赤霉病菌株的基因组DNA，前者提取过程要经分离培养、研磨、抽提、水浴、离心、沉淀、洗涤和干燥等步骤，且提取过程中需使用7～9种试剂，需时5～7 d；Chelex-100法提取DNA仅需直接刮取病穗霉层、水浴、涡旋振荡和离心4个主要步骤，所用试剂仅有20%Chelex-100，整个提取过程大约需12 min。通过整体比较表明，采用Chelex-100法提取小麦赤霉病菌基因组DNA的过程更为快速、简便。

经检测，Chelex-100法提取的DNA质量浓度平均为1 200 ng/μL，OD260/OD280值介于1.75～1.95；CTAB法提取的DNA质量浓度平均为1 500 ng/μL，OD260/OD280值介于1.70～1.90。2种方法提取的基因组DNA均满足PCR的要求。利用特异引物Fg11对2种方法提取的DNA进行扩增检测，结果显示，2种方法提取的DNA样本均能扩增出稳定清晰的目的条带（图1），表明Chelex-100法提取小麦赤霉病菌基因组DNA是可行的，其结果能达到CTAB法的效果。特异引物从安徽白湖菌株扩增出497 bp的片段，为F.asiaticum；从河北安新菌株扩增出410 bp的片段，为F.graminearum（图1）。该结果与已知菌株的鉴定结果一致，表明本试验建立的PCR检测体系具有准确性。

上述结果表明，本研究确立的由改进Chelex-100法快速提取DNA和PCR鉴定体系相结合来检测小麦赤霉病菌种类的方法是可行的，而且具有快速、简便和准确的特点。

2.2 小麦赤霉病菌样本检测验证结果

采用快速检测方法对41份样本进行检测，结果显示，41份材料均能扩增出稳定且清晰的条带，其中22个小麦赤霉病菌样本扩增出大小为497 bp的条带，19个小麦赤霉病菌样本扩增出大小为410 bp的条带（图2）。

根据以上检测结果，在所鉴定的41份样本中，安徽合肥与江苏南京地区小麦赤霉病菌均为F.asiaticum，河北安新与赵县地区小麦赤霉病菌均为F.graminearum，河南地区2种菌株均有出现（表1）。

3 结论与讨论

小麦赤霉病菌种类的检测鉴定是研究小麦赤霉病发生发展及其致病菌群体分布的基础。已报道的赤霉菌检测鉴定方法［3-4，8，16-17，19-20，25-27］，大多首先分离、培养、纯化病原菌菌种，而后采用CTAB法或SDS法提取菌种DNA，操作繁琐，费工费时，仅该过程需耗时5～7 d。Chelex-100法作为一种快速高效提取基因组DNA的方法，已成功应用于植物炭疽病菌、枯萎病菌和镰刀菌等真菌菌丝DNA的提取［30-31］，在白粉病菌分生孢子、小麦条锈菌和叶锈菌夏孢子的基因组DNA提取上也有很好的效果［28，32-33］。为了更为简便、快速和准确地检测赤霉病菌，本研究建立了采用Chelex-100法从标样材料上直接快速提取DNA与特异性分子标记检测相结合的方法，无需分离培养菌株、操作步骤简单、耗时很短，整个检测过程用时仅需3～5 h。但该方法尚存在需改进的地方，如对于检测材料的要求，需采集带有粉红色霉层的病穗，而对于发病症状不典型的材料该方法可能存在一定的不足。若对病菌进行分离培养后再应用该方法，则可简化后期的DNA提取过程，亦能节省一些时间并可避免繁杂的操作过程。

我国小麦赤霉病的致病菌北方地区以F.gram inearum为主，南方地区以F.asiaticum为主，其分布具有很强的区域性。Qu等［34］对1999年分离的小麦赤霉菌组成进行了分析，发现我国小麦赤霉菌中95%的F.asiaticum菌株分布在年均气温大于15℃的温暖地区，59%的F.gram inearum菌株分布在年均气温小于15℃的寒冷地区。胡迎春等［19］对2008年和2009年分离自我国冬小麦上的291株赤霉菌株进行了分析鉴定，发现我国小麦主产区赤霉菌主要由F.gram inearum和F.asiaticum组成，且江苏宿迁市、安徽阜阳市和河南驻马店市是二者分界线，该线以南地区主要为F.asiaticum，该线以北的河北省以及河南省部分地区只有F.graminearum菌株。为验证本研究所确立方法的准确性，对采自河南、河北、安徽、江苏四省的41份样本进行了快速检测，结果与上述情况及其他已报道的小麦赤霉菌种类分布情况一致［8，16-17，19，23-24，26，34-36］，表明该方法在小麦赤霉病菌种类的检测鉴定上具有很高的准确性。

综上，本研究建立的方法可以用于小麦赤霉病菌种类的快速检测，对明确不同地区或某一地区小麦赤霉病菌的群体组成、结构变化及地区分布具有重要作用，并将对小麦赤霉病的田间防治起到一定的指导作用。

［1］ Nussbaumer T，Warth B，Sharma S，et al.Joint transcriptomic and metabolomic analyses reveal changes in the primary metabolism and imbalances in the subgenome orchestration in the bread wheatmolecular response to Fusarium graminearum［J］.G3（Genes，Genomes，Genetics），2015，5（12）：2579-2592.

［2］ 董金皋.农业植物病理学［M］.2版.北京：中国农业出版社，2007：61-66.

［3］ 唐太飞.四川省小麦赤霉病菌对多菌灵的抗药性及DNA多态性研究［D］.雅安：四川农业大学，2011.

［4］ 许娟.安徽小麦赤霉病菌生物学特性及遗传多样性研究［D］.合肥：安徽农业大学，2012.

［5］ McMu llen M，Halley S，Schatz B，et al.Integrated strategies for Fusarium head blightmanagement in the U-nited States［J］.Review of Business Administration，2009，33（2）：39-52.

［6］ Massimo B，M iriam H，Michelangelo P，et al.Integrated strategies for the control of Fusarium head blight and deoxynivalenol contamination in winter wheat［J］.Field Crops Research，2012，133：139-149.

［7］ Pirgozliev S R，Edwards S G，Hare M C，et al.Strategies for the control of Fusarium head blight in cereals［J］.European Journal of Plant Pathology，2003，109（7）：731-742.

［8］ 方兴洲.安徽小麦赤霉病菌菌群分布及产毒类型相关研究［D］.合肥：安徽农业大学，2013.

［9］ Pestka J J.Deoxynivalenol：Mechanism s of action，human exposure，and toxicological relevance［J］.Archives of Toxicology，2010，84（9）：663-679.

［10］ 马信.小麦抗赤霉病相关基因的克隆及功能分析［D］.泰安：山东农业大学，2014.

［11］ 梅爱中，李锌.近年东台小麦赤霉病的发生及其防控对策初探［J］.科学种养，2015（3）：31-32.

［12］ 李学春，黄敏，李彬.2015年沭阳县小麦赤霉病的发生及防控［J］.现代农业科技，2015（14）：134-135.

［13］ 钱国华.小麦赤霉病发生特点及原因分析［J］.农药科学与管理，2013，34（1）：58-60.

［14］ 邓斌.宣州区近几年小麦赤霉病发生情况分析及防控措施［J］.安徽农学通报，2013，19（14）：90-92.

［15］ 郝绪春，方福友，郑仁军.2015年六安市金安区小麦赤霉病发生特点及防治技术［J］.现代农业科技，2015（13）：149-150.

［16］ 柳金伟.山东省小麦赤霉病菌种群组成、产毒化学型及hpa99和AIMYB44转基因小麦研究［D］.泰安：山东农业大学，2012.

［17］ 胡迎春.我国冬小麦主产区小麦赤霉病菌组成、致病力及对多菌灵的抗性研究［D］.南京：南京农业大学，2009.

［18］ 韩永梅.小麦赤霉菌FgCPKA基因敲除及功能研究［D］.呼和浩特：内蒙古师范大学，2011.

［19］ 胡迎春，李伟，陈怀谷，等.中国冬小麦主产区小麦赤霉病菌种群组成及其致病力［J］.江苏农业学报，2010，26（5）：954-960.

［20］ 史文琦，杨立军，冯洁，等.小麦赤霉病流行区镰刀菌致病种及毒素化学型分析［J］.植物病理学报，2011，41（5）：486-494.

［21］ 杨继芝，王继师，龚国淑，等.不同禾谷镰刀菌对小麦产量及其主要性状的影响［J］.河南农业科学，2010（9）：91-95.

［22］ 洪旭.四川省小麦赤霉病菌致病性分化及遗传多样性分析［D］.雅安：四川农业大学，2012.

［23］ Consolo V F，Ortega L M，Salerno G，et al.Genetic diversity of Fusarium graminearum sensu lato isolates from wheat associated with Fusarium head blight in diverse geographic locations of Argentina［J］.Revista Argntentina de Microbiologia，2015，47（3）：245-250.

［24］ 张昊.中国麦类赤霉病菌群体遗传多样性及生态适应性研究［D］.北京：中国农业科学院，2011.

［25］ 薛晓芳，陈莉，陈雨，等.安徽省23个赤霉菌株种群类型分子鉴定［C］//郭泽建，李宝笃.中国植物病理学会2012年学术年会论文集.北京：中国农业科学技术出版社，2012：109-111.

［26］ 周永进.小麦赤霉病致病菌基因型、化学型分化及其致病力分析［D］.南宁：广西大学，2012.

［27］ 张洪滨，柳金伟，刘秉江，等.山东省小麦赤霉病菌种群组成及其致病力分化［J］.植物保护学报，2013，40（1）：27-32.

［28］ 兰茗清，刘林，杨静，等.直接、快速地从罹病小麦叶片中提取条锈菌基因组DNA的方法［J］.云南农业大学学报，2012，27（6）：798-801，813.

［29］ Doohan F M，Parry D W，Jenkinson P，et al.The use of species-specific PCR-based assays to analyse Fusarium ear blight of wheat［J］.Plant Pathology，1998，47（2）：197-205.

［30］ 陈吉良，黄小龙，吴安迪，等.一种快速高效提取病原真菌DNA作为PCR模板的方法［J］.菌物学报，2011，30（1）：147-149.

［31］ 杨歆璇，羊玉花，杨腊英，等.Chelex-100法快速提取镰刀菌基因组DNA［C］//吴孔明.公共植保与绿色防控（中国植物保护学会2010年学术年会）.北京：中国农业科学技术出版社，2010：204-207.

［32］ 刘建利，赵海霞.Chlex-100法快速提取甜瓜白粉病菌基因组DNA［J］.北方园艺，2010（10）：167-169.

［33］ 康健，孟庆芳，张林，等.Chelex-100法提取小麦叶锈菌夏孢子堆基因组DNA的研究［C］//彭友良，缪卫国.中国植物病理学会2015年学术年会论文集.北京：中国农业出版社，2015：126.

［34］ Qu B，Li H P，Zhang J B，et al.Geographic distribution and genetic diversity of Fusarium graminearum and F.asiaticum on wheat spikes throughout China［J］.Plant Pathology，2008，57（1）：15-24.

［35］ 潘晓静，陈楠，姚远，等.东北地区小麦赤霉病镰孢菌种群及其致病性测定［J］.华北农学报，2015，30（3）：205-210.

［36］ 胡公洛，周丽鸿，阎月云.河南省小麦赤霉病菌致病种的鉴定［J］.河南农业大学学报，1992，26（4）：395-399.

A Rapid Detection Method for Gibberella saubinetii

ZHANG Lin，ZHANG Mengya，KANG Jian，YAN Hongfei*，LIU Daqun*
（College of Plant Protection，Agricultural University of Hebei/National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas/Biological Control Center of Plant Diseases and Plant Pests of Hebei Province，Baoding 071000，China）

To establish a rapid，simp le and exactmethod for detection of Gibberella saubinetii in China，this study extracted DNA by using diseased ear directly，and combined with specific molecularmarker for the rapid detection of Gibberella saubinetii.The genom ic DNA of Gibberella saubinetii could be rapid ly extracted and successfully detected by specificmolecularmarkerwith this detection method.Through the detection and verification of 41 samp les from four provinces（Hebei，Henan，Jiangsu and Anhui provinces），the results showed that18 samples from Anhuiand Jiangsu were Fusarium asiaticum，12 samples from Hebei were Fusarium gram inearum，and two pathogenic strains existed in the 11 samp les from Henan.The detection result consisted with the situation of regional distribution of two pathogenic strains.The method can not only achieve the effect of traditionalmethods（DNA is extracted by CTAB method），but also have the advantages of rapidness and simplicity.It can be used in the study of population structure and regional distribution of Gibberella saubinetii.

wheat；Gibberella saubinetii；rapid detection；Fusarium gram inearum；Fusarium asiaticum

S435.121.4+5

A

1004-3268（2017）01-0088-05

2016-07-30

国家重点基础研究发展计划项目（2013CB127700）；河北省自然科学基金项目（C2015204105）

张 林（1989-），男，河北石家庄人，在读硕士研究生，研究方向：分子植物病理学。E-mail：772458080@qq.com

*通讯作者：闫红飞（1975-），男，河北保定人，副教授，博士，主要从事植物病害生物防治与分子植物病理学研究。E-mail：hongfeiyan2006@163.com刘大群（1958-），男，河北石家庄人，教授，博士，主要从事植物病害生物防治与分子植物病理学研究。