阿魏中阿魏酸的提取方法及抑菌作用研究

阿来·海拉希，德丽达·木拉提别克，迪丽努尔·马力克



阿魏中阿魏酸的提取方法及抑菌作用研究

阿来·海拉希，德丽达·木拉提别克，迪丽努尔·马力克*

（新疆师范大学 化学化工学院, 新疆 乌鲁木齐 830054）

研究阿魏中阿魏酸的提取工艺及其抑菌作用。用L9(34)正交试验超声波和微波辅助乙醇提取阿魏酸；用平板打孔法和试管稀释法研究不同质量浓度阿魏酸提取物对3种供试菌的抑菌作用。超声提取的最佳工艺条件是料液比1∶30（g/mL）、超声功率200 W、超声温度50 ℃和超声时间20 min；在此条件下，提取率达到0.542 mg/g。微波提取的最佳工艺条件是以80%的乙醇为提取溶剂、料液比1∶30（g/mL）、微波功率450 W和微波时间10 min，提取率可达0.556 mg/g。抑菌试验显示优选的微波提取的阿魏酸提取物对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌都具有抑制作用。实验结果可为阿魏中阿魏酸提取工艺的确定及在抑菌方面的应用提供实验依据。

超声波；微波；阿魏酸；抑菌作用；正交试验

阿魏为伞形科植物新疆阿魏［1］Ferula sinkiang- ensis K. M. Shen，最早的药用记录可追溯至明朝李时珍的《本草纲目》。其主要成分阿魏酸［2］(ferulic acid简称FA)作为一种酚酸类物质广泛存在于植物界中。研究发现，阿魏酸具有抗菌、抗抑郁、降压［3-5］等活性。不仅具有明显的抗氧化和自由基清除作用［6］，还可预防和减少此波长紫外线对皮肤的损伤［7］。从植物中提取阿魏酸的方法有很多种，其中超声法具有节能和高效的特点，是通过空化、机械和热效应等作用使药材的有效成分充分转移到溶剂中的过程［8］。其容易受到超声波频率、超声波发生器类型、液体的界面性质及声强等的影响［9］。微波法具有高效和污染低特点，是利用微波能同时加热和药材相接触的溶剂，可使有效成分从药材里转移至溶剂中［10］。本研究是以阿魏为原料，用乙醇作为提取溶剂通过微波法和超声法提取阿魏中的阿魏酸并做对比，并对优选出的微波提取的阿魏酸提取物的抑菌作用进行了探究，为阿魏植物的发展奠定了必要的理论基础。

1 实验部分

1.1 材料、试剂与仪器

阿魏（采自新疆和田地区）；阿魏酸标准品（中国药品生物制品检定所）；蛋白胨、琼脂粉、酵母膏、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌(均由新疆师范大学生命科学学院提供)，其余试剂均为分析纯。

XH-300B微波超声波组合合成/萃取仪；UV-2100紫外可见光分光光度计；RE-52AA旋转蒸发仪；SHZ-D循环水式真空泵；HWS-26电热恒温水浴锅。

1.2 实验方法

1.2.1 阿魏中阿魏酸提取液的制备

准确称取过16目筛、石油醚回流脱脂的阿魏根粉末1.00 g，按一定的比例加入75%乙醇，置于超声-微波协同萃取仪中，按一定的条件下进行超声和微波提取。提取液抽滤、离心、减压浓缩至浸膏状回收溶剂并用75%乙醇定容，测定所得提取液的阿魏酸含量。

1.2.2 阿魏酸含量的测定

称取阿魏酸标准品10 mg，用质量分数75%乙醇定容至100 mL，所得阿魏酸标准溶液的溶度为0.1 mg/mL。分别移取0.0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL标准溶液至10 mL容量瓶中，用质量分数75%乙醇定容，测定310 nm处的吸光度。每个质量浓度做3次平行并取平均值，绘制标准曲线，得到吸光度与阿魏酸溶液质量浓度（mg/mL）之间的回归方程为=0.6683-0.0024，²=0.9998，质量浓度与吸光度成良好的线性关系（图1）。

图1 阿魏酸标准曲线

1.2.3 阿魏酸提取率的测定

稀释样品提取液一定的倍数后，测定310 nm处的吸光度值，代入回归方程，计算得出阿魏中阿魏酸的浓度，按下式得到阿魏酸的提取率( mg/g)。

阿魏酸提取率=（1）

式中：—阿魏酸浓度，mg /mL；

—溶液体积，mL；

—稀释倍数；

—称取样品的质量，g。

1.2.4 单因素实验对超声提取阿魏酸条件的优化

准确称取预处理后的阿魏根粉末1.00g，以75%乙醇为提取溶剂，固定微波功率0，考察表1中的各因素对阿魏酸提取率的影响。按照各单因素条件，进行单因素条件优化实验。

表1 超声提取单因素条件优化表

1.2.5 单因素实验对微波提取阿魏酸条件的优化

准确称取预处理后的阿魏根粉末1.00 g，固定超声功率0，微波温度50 ℃，考察表2对阿魏酸提取率的影响。按照微波提取阿魏酸的各单因素条件，进行单因素条件优化实验。

表2 微波提取单因素条件优化表

1.2.6 超声提取因素水平的选取

为了进一步确定超声波提取的最佳工艺参数，在单因素实验的基础上，L9(34)正交试验分析料液比、功率、时间和温度4种因素，因素水平如表3所示。

表3 超声波正交试验因素水平表

1.2.7 微波提取因素水平的选取

采用L9(34)正交验，考察乙醇浓度、料液比、功率和时间对阿魏中阿魏酸的提取率的影响，并确定实验因素的水平。见表4。

表4 微波正交试验因素水平表

1.2.8 阿魏酸的抑菌作用

（1）培养基制备

培养基LB成分：蛋白胨10 g、NaCl 10 g、酵母粉5 g、去离子水定容至1000 mL，用1 mol/L NaOH调pH为7。LB固体培养基：将1.6%琼脂粉加入到LB液体培养基，煮沸后定容，在120 ℃灭菌处理20 min。

（2）菌液的制备[11]

将细菌接种到37 ℃活化培养24 h的斜面培养基上，于36 ℃、180 r/min震荡培养17h。取0.1 mL菌液并用生理盐水稀释至10 000倍以备用。

（3）抑菌实验

打孔法：使用琼脂打孔器（直径6 mm）均匀打孔，每板各打4孔，去除孔内琼脂并且适当封闭孔底。每孔均加阿魏中阿魏酸提取物并依次作标记，1 h后置于恒温培养箱中37 ℃培养24 h。空白对照组加入等量的DMSO溶液(质量分数为0.1% )观察结果。

试管稀释法：取5支试管并标记序号，首先在1号管中加入阿魏酸提取液和培养液各1 mL，混合均匀后准确吸取1 mL加入2号管中，依次倍比稀释至4号管，混匀后从4号管弃去1 mL。阿魏酸浓度分别为0.758、0.379、0.189和0.095 mg/mL (第5管为对照)。每管继续加0.2 mL菌液于37 ℃下培养一昼夜后观察结果。经观察后将每试管中吸取的0.2 mL培养物接种到无菌固体培养基上，37 ℃下继续培养12 h后观察是否有菌生长。最低抑菌浓度(MIC)是完全没有菌生长的平板所对应的提取物浓度。

2 结果与分析

2.1 超声提取单因素试验

2.1.1 料液比的确定

实验条件同1.2.1节，料液比对提取率的影响见图2。

图 2 料液比对提取率的影响

如图2，阿魏酸的提取率跟料液比呈正比，料液比为1:30 (g/mL)时，阿魏中阿魏酸的提取率最大；1:30 (g/mL)后提取率趋于下降，这是由于在超声波的作用下溶出阿魏酸的同时还能溶出更多其他物质，使提取液扩散速度变慢，黏度变大，导致阿魏酸不易溶出。故料液比为1:30(g/mL)为宜。

2.1.2 超声功率的确定

超声功率对阿魏中阿魏酸提取率的影响实验结果如图3所示。

图3 超声功率对提取率的影响

阿魏中阿魏酸的提取率随着超声功率的增大而升高，在200 W时趋近于最大值；当超声功率继续增大，阿魏中阿魏酸的提取率开始减少。这是由于超声功率过大导致阿魏酸不太稳定而分解，使得阿魏酸的提取率降低。故超声功率选择200 W为最佳。

2.1.3 超声时间的确定

超声时间对阿魏中阿魏酸提取率的影响实验结果见图4。

图4 超声时间对提取率的影响

分析实验结果可知，在5～20 min时，提取率随超声时间的增加而逐渐升高。20 min 时，提取率达到最高值。超过20 min 时，阿魏酸的提取率开始有下降的趋势；这是因为阿魏酸暴露在空气中容易被氧化破坏[12]，使得到的阿魏酸随时间的延长而减少。所以，超声时间选择20 min为最佳。

2.1.4 超声温度的确定

超声温度对阿魏中阿魏酸提取率的影响实验结果如图5所示。

图5 超声温度对提取率的影响

温度在30～50 ℃时，阿魏中阿魏酸的提取率随着温度的升高而不断地增加，50 ℃时阿魏酸的提取率最高。原因是温度升高，分子运动速度加快使得植物细胞壁的破裂加速，阿魏酸更容易浸出，提取率升高。继续升高温度阿魏酸的提取率有所下降，这可能是温度太高使植物组织软化，利于加快溶解可溶性成分，多糖或其他溶出量增多致使阿魏酸提取率下降［13］。

2.2 阿魏中阿魏酸的超声提取正交试验

2.2.1 数据处理及结果分析

根据单因素实验结果，按照L9(34)正交表进行正交实验，正交因素水平如表5所示。

表5 超声辅助提取正交试验分析结果

由表5可知，超声波提取阿魏中阿魏酸的最佳工艺条件为2212，即料液比为1∶30 (g/mL) 、超声功率200 W、超声温度50 ℃和超声时间20 min。各因素对阿魏酸提取率的影响程度依次为料液比（）＞超声温度（）＞超声时间（）＞超声功率（）。由表6方差分析可知料液比表现出显著性差异，而功率、温度和时间未表现出显著性差异。

表6 超声辅助提取方差结果

2.3 微波提取单因素实验

2.3.1 乙醇浓度的确定

乙醇浓度对阿魏中阿魏酸提取率的影响实验结果如图6所示。

图6 乙醇浓度对阿魏中阿魏酸提取率的影响

由图6可知，阿魏中阿魏酸的提取率随乙醇浓度的增加而增大，80%处出现最大值；再增大乙醇浓度，阿魏酸提取率反而有所下降；这可能是因为随着乙醇浓度的增大阿魏酸化合物的溶解度也随之增加，所以其提取率也增加；当乙醇浓度过大时，一些醇溶性杂质、色素等的浸出量也有所增加，这些成分会同乙醇-水分子结合，使得阿魏酸提取率降低［14］。综合考虑，乙醇体积分数选择80%为最佳。

2.3.2 微波提取阿魏酸料液比的确定

料液比对阿魏中阿魏酸提取率的影响实验结果如图7所示。

图7 料液比对提取率的影响

由图7可知，阿魏酸提取率跟料液比成正比，料液比达到1∶30 (g/mL)时提取率最大；大于1∶30 (g/mL)时提取率趋于下降，这是由于原料一定时，水解效率会随提取溶剂量的增加而增加；但是如果提取溶剂用量太大，一方面会使得溶液浓缩时能耗增大，另一方面，也会使得释放出的阿魏酸在后续处理过程中更易受到氧化作用而被破坏，故选用1:30 (g/mL)为最佳。

2.3.3 微波时间的确定

微波时间对阿魏中阿魏酸提取率的影响实验结果如图8所示。

图8 微波时间对提取率的影响

阿魏是热敏性物质，微波加热10 min时含量达到最高值。当微波时间大于10 min时阿魏中阿魏酸的提取率下降。继续延长时间只会加快水分蒸发，从而使溶液中的杂质增加，阿魏酸含量下降。因此，微波时间为10 min最佳。

2.3.4 微波功率的确定

图9 微波功率对提取率的影响

微波功率对阿魏中阿魏酸提取率的影响实验结果如图9所示。

阿魏酸提取率随微波功率增大而增加，在450 W时趋于最大值，随着功率的增加，物质吸收的微波能越多，物质升高温的速率越快，越有利于浸出有效成分；但是当功率>450 W时，功率过高可能会破坏多糖的结构，导致提取率下降。故微波功率选取450 W为最佳。

2.4 微波提取正交试验

2.4.1 数据处理以及结果分析

表7 微波辅助提取正交试验分析结果

表8 微波辅助提取方差分析结果

由表7极差分析可知，超声波提取阿魏中阿魏酸最佳工艺条件为2222即乙醇浓度80%、料液比1:30、微波功率450 W和微波时间10 min。各因素对阿魏酸提取率的影响顺序为：料液比（）＞微波功率（）＞微波时间（）＞乙醇浓度（）。从表8方差分析可知，料液比和功率表现出显著性差异，而乙醇浓度和时间未表现出显著性差异。

2.5 两种提取方法的最佳工艺参数的确定

为了确定超声波和微波通过正交试验得到的最佳提取工艺条件的合理性，分别进行3次实验验证：按照2212的条件进行超声波提取；按照2222的条件进行微波提取，结果如表9。

由表9可知，以微波最佳工艺条件进行提取，得到阿魏中阿魏酸提取率为0.556 mg/g ，RSD 0.95%，与微波相比，超声波最佳工艺条件得到的阿魏酸提取率略低为0.542 mg/g，RSD=1.12%。

表明正交试验优化所得的工艺条件准确可靠，且微波法提取阿魏酸的提取率均值(0.556 mg/g)优于超声波提取阿魏酸的提取率均值( 0.542 mg/g )，因此选取微波提取法最为合适。

2.6 阿魏中阿魏酸的提取液的抑菌活性研究

分析表10和图10可知，阿魏中阿魏酸对枯草芽孢、杆菌大肠杆菌和金黄色葡萄球菌都有不同程度的抑制作用。其抑菌作用的影响程度分别为：金黄色葡萄球菌>枯草芽孢杆菌>大肠杆菌。

表10 滤纸片扩散方法测定阿魏酸的抑菌圈直径(mm)

图10 滤纸圆片扩散法测定阿魏酸抑菌活性现场照

3 结论

本研究以阿魏为原料，采用超声波法和微波法提取阿魏酸，是在单因素实验的基础上，通过正交的方差分析优化提取工艺。比较了超声波法和微波法提取阿魏酸的提取率。超声波提取各因素对阿魏酸提取率的影响程度为：料液比（）＞超声温度（）＞超声时间（）＞超声功率（）；优化的最佳超声工艺条件为：料液比1∶30（g/mL）、超声功率200 W、超声温度50 ℃和超声时间20 min、提取率0.542 mg/g；微波提取各因素对阿魏酸提取率的影响程度为：料液比（）＞微波功率（）＞微波时间（）＞乙醇浓度（），优化的最佳微波工艺条件为：乙醇浓度80%、料液比1∶30（g/mL）、微波功率450 W和微波时间10 min，阿魏酸提取率为0.556 mg/g。相对于超声法而言，微波提取阿魏酸能有效缩短提取时间，且提取率高；优选出的微波提取阿魏中阿魏酸提取物对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌和大肠杆菌均有抑制作用。对菌株的抑制作用随着浓度的增加而增强；抑制效果顺序为金黄色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌＞大肠杆菌。为工业化提取植物有效成分和开发利用阿魏酸的抑菌作用具有重要的实际意义和应用前景。

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Study on Extraction Methods and Antibacterial Activity of Ferulic Acid From Ferula Asafoetida

，DILINUER Malike

（Department of Chemical Engineering, Xinjiang Normal University, Urumqi 830054, China）

To investigate the extraction process and antimicrobial activity of ferulic acid (FA) from ferula asafetida, orthogonal array design was employed to optimize extraction conditions of ultrasonic and microwave. The antibacterial effect of FA extract at different concentrations on 3 strains was evaluated by agar diffusion and broth dilution methods. The results showed that, the best condition of ultrasonic extraction was as follows: the power 200 W, extraction temperature 50 ℃, extraction time 20 min and the ratio of material to liquid 1∶30 g/m. Under the optimized conditions, the extraction rate of FA was 0.542 mg/g. The best condition of microwave extraction was as follows: the ratio of material to liquid 1∶30 (g/mL), the microwave power 450 W, ethanol concentration 80%, extraction time 10 min.The extraction rate of FA rate was 0.556 mg/g. FA had inhibitory effect on all tested strains. This study can provide experimental reference for further development and utilization of ferulic acid.

Ultrasonic; Microwave; Ferulic acid; Antibacterial effect; Orthgonal experiment

TQ 041

A

1671-0460（2017）12-2454-06

国家自然科学基金，项目号：21165018。

2017-11-17

阿来·海拉希（1991-），女，新疆省额敏县人，在读研究生，研究方向：天然产物的分离分析。E-mail：1369506078@qq.com。

迪丽努尔·马力克（1964-），女，教授，研究方向：天然产物的分离分析。E-mail：pkudilnur@sina.com。